miR-568通過下調(diào)AKR1B10表達(dá)影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和凋亡

姚慶東，張福生，張國(guó)順，殷會(huì)詠，張一平，孟艷舉

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是常見的原發(fā)性腦部腫瘤，中位生存期約為12 個(gè)月，具有較高的病死率［1］。該疾病的治療主要是外科手術(shù)輔助放、化療［2］，但目前的治療方法并不能改善病人的長(zhǎng)期生存率。從分子水平了解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)于提高治療療效、改善病人生存期具有積極意義。miR-568 是一種在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)的微小RNA（miRNA），miR-568 表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移［3］。但目前，miR-568 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，醛酮還原酶家族1 成員B10（AKR1B10）可能是miR-568的靶基因。AKR1B10 主要表達(dá)于正常的消化道上皮中，而在其他組織中不表達(dá)或表達(dá)水平極低［4］。張茜［5］研究顯示，AKR1B10 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平高于正常腦組織，其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤大小呈正相關(guān)，過表達(dá)AKR1B10 可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

本研究自2018 年12 月至2019 年7 月，探討了miR-568 能否靶向AKR1B10 調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡，以期為該腫瘤的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251、T98G 和SHG44，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；四甲基噻唑藍(lán)（MTT），美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清，浙江天杭；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基和BCA蛋白測(cè)定試劑盒，北京索萊寶；PCR 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒，大連寶生物；蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)所需，中國(guó)Abcam 公司；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國(guó)Invitrogen 公司；引物序列、miR-568 模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-568）、AKR1B10 小干擾RNA（si-AKR1B10）及小干擾RNA陰性序列（si-NC）、模擬對(duì)照序列（miR-NC）和抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）、AKR1B10 過表達(dá)載體（pcDNA-AKR1B10）和空載體（pcDNA）、AKR1B10野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告基因載體，上海生工。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（U251、T98G 和SHG44）均用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基）培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種U251 細(xì)胞于6 孔板中，接種個(gè)數(shù)為1.0×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24h后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR-568 mimics（miR-568 組）、miR-NC（miR-NC 組）、anti-miR-568（anti-miR-568 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、si-AKR1B10（si-AKR1B10 組）、si-NC（si-NC 組）、共轉(zhuǎn)染miR-568 mimics 與pcDNA-AKR1B10（miR-568+pcDNA-AKR1B10 組）、miR-568 mimics 與pcDNA（miR-568+pcDNA 組），轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h。檢測(cè)細(xì)胞中miR-568 或AKR1B10 表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測(cè)miR-568 和AKR1B10 mRNA表達(dá) Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：設(shè)置溫度為95 ℃，預(yù)變性5 min；然后95 ℃進(jìn)行變性（時(shí)間為10 s），之后設(shè)置溫度為60 ℃進(jìn)行退火（時(shí)間30 s），最后設(shè)置溫度為72 ℃延伸（時(shí)間30 s），并重復(fù)此過程，共35 個(gè)循環(huán)。miR-568 正向引物5'-ATGTATAAATGTATACACAC-3'，反向引物5'-GTGTGTATACATTTATACAT-3'；AKR1B10正向引物5'-TCATACGGATCCACCATGGCCACGTTTGT-3'，反向引物5'-CTGCTCGAATTCTCAATATTCTGCATTGAAGGGAT-3'；U6 正向引物5'-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3'，反向引物5'-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3'；GAPDH正向引物5'-CATCGAGCACGGCATCGTCA-3'，反向引物5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-568相對(duì)U6、AKR1B10 mRNA相對(duì)GAPDH的表達(dá)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)AKR1B10、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)RIPA試劑提取各組細(xì)胞中總蛋白，經(jīng)BCA 法測(cè)蛋白濃度后，利用SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分離。將分離蛋白先轉(zhuǎn)至PVDF 膜，放于5%脫脂奶粉中進(jìn)行封閉（時(shí)間為1 h）。然后于4 ℃冰箱中，分別放置在沉默醛酮還原酶家族1 成員B10（AKR1B10）（1∶500）、細(xì)胞周期蛋白1（CyclinD1）（1∶500）、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（p21）（1∶50）、B 細(xì)胞淋巴癌/白血病-2 基因（Bcl-2）（1∶100）、前凋亡蛋白（Bax）（1∶100）和甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗中孵育過夜。洗膜后，再放在山羊抗兔二抗（1∶200）中孵育（37 ℃、1 h）。加顯影液顯影，曝光拍照。

1.2.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 接種轉(zhuǎn)染后細(xì)胞至96孔板中，接種個(gè)數(shù)均為1.0×104個(gè)/孔板中。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加5 g/L MTT（每孔20 μL），孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加二甲基亞砜（每孔150 μL），混合均勻。將96 孔板設(shè)入酶標(biāo)儀卡槽中，設(shè)置波長(zhǎng)為490 nm，測(cè)定吸光度（OD）值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 接種轉(zhuǎn)染后細(xì)胞至24 孔板中，接種個(gè)數(shù)均為5.0×104 個(gè)/孔。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，收集各組細(xì)胞。嚴(yán)格按照Annexin VFITC/PI試劑盒操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 接種U251 細(xì)胞于6 孔板中，接種個(gè)數(shù)為1.0×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別共轉(zhuǎn)染miR-568 mimics 與AKR1B10-WT（或AKR1B10-MUT）、miR-NC 與AKR1B10-WT（或AKR1B10-MUT），轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h。然后裂解各組細(xì)胞，3 500 r/min 離心10 min。取20 μL 上清液，加100 μL 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液，混合均勻，檢測(cè)螢火蟲或海腎的熒光強(qiáng)度。用螢火蟲與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-568 和AKR1B10 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（U251、T98G 和SHG44）中miR-568 表達(dá)均低于HA1800 細(xì)胞（P＜0.05），AKR1B10 mRNA 和蛋白表達(dá)均高于HA1800細(xì)胞（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 miR-568和AKR1B10在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)/

表1 miR-568和AKR1B10在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)/

注：HA1800 為正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，U251、T98G、SHG44 均為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，miR-568為微小RNA-568，AKR1B10 mRNA為醛酮還原酶家族1 成員B10 基因，AKR1B10 為醛酮還原酶家族1 成員B10蛋白。①與HA1800細(xì)胞比較，P＜0.05。

圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中AKR1B10蛋白表達(dá)

2.2 miR-568 靶向調(diào)控AKR1B10的表達(dá)AKR1B10 的3’UTR 與miR-568 互補(bǔ)的核苷酸序列見圖2A。

共轉(zhuǎn)染miR-568 mimics 與AKR1B10-WT 的U251 細(xì)胞熒光素酶活性為（0.43±0.03），較共轉(zhuǎn)染miR-NC與AKR1B10-WT的U251細(xì)胞熒光素酶活性（1.01±0.09）顯著降低（t=17.60，P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染miR-568 mimics 與AKR1B10-MUT 的U251 細(xì) 胞熒光素酶活性為（1.02±0.09），與共轉(zhuǎn)染miR-NC與AKR1B10-WT 的U251 細(xì)胞熒光素酶活性（1.04±0.08），比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.36，P=0.727）。

miR-568組AKR1B10蛋白表達(dá)量為（0.24±0.03），較miR-NC 組0.61±0.06顯著降低（t=16.55，P＜0.05）；anti-miR-568組AKR1B10蛋白表達(dá)量為（0.96±0.08），較anti-miR-NC組（0.58±0.05）顯著升高（t=12.08，P＜0.05），見圖2B。

圖2 miR-568靶向調(diào)控AKR1B10的表達(dá)：A為AKR1B10的3’UTR與miR-568互補(bǔ)的核苷酸序列；B為miR-568對(duì)AKR1B10蛋白表達(dá)的影響

2.3 上調(diào)miR-568 對(duì)U251 細(xì)胞增殖和凋亡的影響miR-568在miR-568 組U251 細(xì)胞中的表達(dá)量為2.38±0.24，較miR-NC組1.01±0.08顯著升高（t=22.46，P＜0.05）。miR-568 組U251 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h 后的OD 值，較miR-NC 組均降低（P＜0.05），見表2。miR-568組U251細(xì)胞凋亡率為［（22.41±2.15）%］，較miR-NC 組（6.58±0.67）%，升 高（t=21.07，P＜0.05），見圖3。

圖3 上調(diào)miR-568對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響：A為上調(diào)miR-568的U251細(xì)胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B為流式細(xì)胞儀檢測(cè)上調(diào)miR-568的U251細(xì)胞凋亡

表2 上調(diào)miR-568對(duì)U251細(xì)胞增殖（波長(zhǎng)為490 nm時(shí)測(cè)定吸光度）的影響/

表2 上調(diào)miR-568對(duì)U251細(xì)胞增殖（波長(zhǎng)為490 nm時(shí)測(cè)定吸光度）的影響/

注：miR-NC為微小RNA-568陰性對(duì)照，miR-568為微小RNA-568。

同時(shí)，miR-568 組U251 細(xì)胞中增殖和凋亡相關(guān)蛋白CyclinD1 和Bcl-2 表達(dá)均低于miR-NC 組［CyclinD1：（0.32±0.03）比（0.78±0.07），t=18.44，P＜0.05；Bcl-2：（0.29±0.03）比（0.67±0.07），t=16.29，P＜0.05］，p21 和Bax 表達(dá)均高于miR-NC 組［p21：（0.58±0.05）比（0.22±0.03），t=18.88，P＜0.05；Bax：（0.72±0.07）比（0.31±0.03），t=16.66，P＜0.05］。

2.4 下調(diào)AKR1B10 對(duì)U251 細(xì)胞增殖和凋亡的影響AKR1B10 蛋白在si-AKR1B10 組U251 細(xì)胞中的表達(dá)量為0.28±0.03，較si-NC 組0.63±0.06 顯著降低（t=15.11，P＜0.05）。si-AKR1B10 組U251 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h 后的OD 值均較si-NC 組均降低（P＜0.05），見表3。

表3 下調(diào)AKR1B10對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響/

表3 下調(diào)AKR1B10對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響/

注：si-NC 為陰性對(duì)照，si-AKR1B10 為沉默醛酮還原酶家族1 成員B10基因。

si-AKR1B10 組U251細(xì)胞凋亡率為（21.26±2.14）%，較si-NC 組（8.02±0.78）%升高（t=17.42，P＜0.05），見圖4。

圖4 下調(diào)AKR1B10的U251細(xì)胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

同時(shí)，si-AKR1B10 組U251 細(xì)胞中增殖和凋亡相關(guān)蛋白CyclinD1和Bcl-2表達(dá)均低于si-NC 組［CyclinD1：（0.35±0.03）比（0.76±0.07），t=17.13，P＜0.05；Bcl-2：（0.32±0.03）比（0.69±0.07），t=15.12，P＜0.05］，p21 和Bax 表達(dá)均高于si-NC 組［p21：（0.56±0.05）比（0.21±0.03），t=16.59，P＜0.05；Bax：（0.67±0.07）比（0.29±0.03），t=14.65，P＜0.05］。

2.5 上調(diào)AKR1B10 逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-568 對(duì)U251 細(xì)胞增殖和凋亡的影響miR-568+pcDNA-AKR1B10組U251 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h 后的OD 值、CyclinD1 和Bcl-2蛋白表達(dá)均高于miR-568+pcDNA組（P＜0.05），凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)均低于miR-568+pcDNA組（P＜0.05）。見圖5、表4。

圖5 AKR1B10和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 上調(diào)AKR1B10逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-568對(duì)U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響/

表4 上調(diào)AKR1B10逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-568對(duì)U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響/

注：miR-NC 為微小RNA-568 陰性對(duì)照，miR-568 為微小RNA-568，miR-568+pcDNA 為微小RNA-568 過表達(dá)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的表達(dá)空載體，miR-568+pcDNA-AKR1B10為微小RNA-568過表達(dá)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的表達(dá)醛酮還原酶家族1成員B10基因載體。①與miR-NC組比較，P＜0.05。②與miR-568+pcDNA組比較，P＜0.05。

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展與多種編碼基因和非編碼基因的異常表達(dá)密切相關(guān)［6-7］。研究表明，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在大量異常表達(dá)的miRNA，如miR-199a-5p、miR-628-5p 和miR-423-5p，這些miRNA 參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)［8-10］。作為一種miRNA，miR-568 在腫瘤中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響也被廣泛關(guān)注。雷桃香［11］研究顯示，miR-568靶向抑制CDK4的表達(dá)阻礙宮頸癌細(xì)胞增殖；李俊堂［12］研究顯示，miR-568 是乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的一種miRNA，上調(diào)miR-568對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移起抑制作用。

本研究顯示，miR-568 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的表達(dá)較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯降低，提示miR-568參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展；進(jìn)一步上調(diào)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-568 的表達(dá)引起細(xì)胞增殖能力降低，而凋亡加劇，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白CyclinD1 和Bcl-2 表達(dá)降低，而p21 和Bax 表達(dá)升高，這提示上調(diào)miR-568 可能抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展，miR-568 有可能成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的分子靶點(diǎn)。

AKR1B10 基因位于7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂3 區(qū)3 帶，是一種致癌基因。Wang 等［13］研究顯示，AKR1B10表達(dá)的上調(diào)通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Zhou 等［14］研究顯示，沉默AKR1B10 表達(dá)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低，細(xì)胞周期阻滯，AKR1B10 可能是肺癌的潛在診斷和治療靶點(diǎn)。Xiao 等［15］研究顯示，過表達(dá)AKR1B1可通過ERK1/2 途徑促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，AKR1B10 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，下調(diào)AKR1B10 表達(dá)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，提示下調(diào)AKR1B10有可能延緩膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展進(jìn)程。為探究miR-568 抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了miR-568 靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控AKR1B10。此外，本研究利用恢復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)AKR1B10逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-568對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，提示miR-568 通過靶向下調(diào)AKR1B10來影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，miR-568 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，而AKR1B10 表達(dá)上調(diào)。上調(diào)miR-568 可通過靶向抑制AKR1B10 的表達(dá)阻礙膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-568/AKR1B10 軸有可能為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供了新靶點(diǎn)。