浙貝母灰霉病病原真菌的分子鑒定

李吉二 溫思思 張羽加 金洛稼 趙偉春

摘要 為了鑒定引起浙貝母Fritillaria thunbergii Miq. 灰霉病的病原真菌，于2015年-2019年收集浙貝母灰霉病樣品，采用常規(guī)組織分離法在PDA培養(yǎng)基上分離純化獲得10株葡萄孢屬Botrytis真菌。進(jìn)一步以內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、RNA聚合酶亞基Ⅱ（the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzyme Ⅱ，RPB2）、熱激蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，G3PDH）為DNA條形碼，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，運(yùn)用CodonCode Aligner拼接序列及BLAST分析，這10個(gè)菌株序列相同，為同一菌株，在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA 10.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定此菌株與灰葡萄孢Botrytis cinerea相應(yīng)序列的一致性為100%。盆栽接種法檢測(cè)表明此菌株可引起浙貝母灰霉病。據(jù)此認(rèn)為浙貝母灰霉病的病原真菌是灰葡萄孢而非普遍認(rèn)為的橢圓葡萄孢Botrytis elliptica。

關(guān)鍵詞 浙貝母; 灰霉病; 病原真菌; 灰葡萄孢; 分子鑒定

中圖分類號(hào)： S435.672

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021091

Abstract In order to identify the pathogenic fungi causing grey mold on Fritillaria thunbergii Miq.， the disease samples were collected from 2015 to 2019， conventional tissue isolate method was used to isolate and purify the pathogen from samples on PDA medium and the ten isolates belonging to Botrytis were obtained. The specific sequence of ITS （internal transcribed spacer）， RPB2 （the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzymeⅡ）， HSP60 （heat shock protein 60） and G3PDH （glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase） were used as DNA barcode. They were amplified by PCR and sequenced， respectively. The sequences were spliced using CodonCode Aligner software and then BLAST analysis was carried out. These ten isolates are same strain with same sequence. The sequences were aligned in GenBank， and the phylogenetic trees were constructed using MEGA 10.1 software. The results showed that this strain shared 100% identity with Botrytis cinerea. The pathogenicity test by in vivo pot inoculation revealed that this strain can cause gray mold disease on F.thunbergii. Therefore， the pathogenic fungus causing mold disease of F.thunbergii is B.cinerea rather than B.elliptica， which was generally believed.

Key words Fritillaria thunbergii; grey mold disease; pathogenic fungus; Botrytis cinerea; molecular identification

浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.為百合科Liliaceae貝母屬Fritillaria多年生草本植物，著名的“浙八味”之一。目前在浙江、江西、湖南、江蘇和安徽大面積栽培，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入的主要來(lái)源[1]。然而，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，重茬和鱗莖營(yíng)養(yǎng)繁殖，浙貝母病害發(fā)生日益突出，其中以灰霉病危害最重，高發(fā)年病株率達(dá)82%以上[23]，2017年，2018年，2020年浙江省磐安縣浙貝母灰霉病普遍發(fā)生，部分田塊全田枯死，藥農(nóng)普遍稱之為“難治之癥”，每年給種植戶造成10%～30%的損失[12，45]。

浙貝母灰霉病，也稱“早枯”“青塌腐”“眼圈病”。葉、莖、花、果實(shí)均能受害，以葉片的癥狀最為明顯，葉片染病，有時(shí)病斑上長(zhǎng)出灰色霉?fàn)钗铮瑲埩粼谔镩g的菌核、菌絲體和分子孢子是次年灰霉病發(fā)生的主要侵染來(lái)源[1， 3， 6]。李云山等采用形態(tài)學(xué)觀察法將引起此病的病原鑒定為橢圓葡萄孢Botrytis elliptica（Berk.）Cooke[7]。宗侃侃等則認(rèn)為浙貝母灰霉病的致病菌是灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers[1]，但未對(duì)其進(jìn)行鑒定。至今未見(jiàn)有利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)浙貝母灰霉病的致病菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定的報(bào)道。Staats等利用RPB2、HSP60、G3PDH等3個(gè)核基因分析了葡萄孢屬Botrytis 23個(gè)種（包括1個(gè)雜交種）及其寄主的進(jìn)化關(guān)系[8]。為了明確浙貝母灰霉病致病菌的種類，本研究從浙江省磐安縣獲得浙貝母灰霉病病株并從中分離純化病原菌，通過(guò)觀察癥狀、菌落及孢子形態(tài)，并采用DNA條形碼技術(shù)[9]結(jié)合致病性檢測(cè)對(duì)其致病菌進(jìn)行分類鑒定，為浙貝母灰霉病的監(jiān)測(cè)和防治及生物學(xué)研究提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。gzslib202204041314

1 材料與方法

1.1 材料

浙貝母灰霉病植株：自2015年-2019年連續(xù)5年從浙江省磐安縣冷水鎮(zhèn)白巖村、新渥鎮(zhèn)彈上村等浙貝母栽培基地采集葉片褪綠黃化，呈水浸狀斑塊或莖稈表面褐變濕腐，病斑上有灰色霉層等[1]疑似浙貝母灰霉病病株8株，帶回實(shí)驗(yàn)室用于病原真菌的分離，記錄采集時(shí)間、采集地點(diǎn)、樣品編號(hào)和病害癥狀。

對(duì)病原菌的ITS、RPB2、HSP60、G3PDH基因擴(kuò)增和測(cè)序。所用通用引物序列及PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[1013]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分離純化

采用常規(guī)組織分離法[1415]分離純化浙貝母灰霉病病原真菌。病株經(jīng)清水、無(wú)菌水沖洗后用75%乙醇浸泡1 min，1%NaClO溶液消毒5 min，再用75%乙醇漂洗50 s，最后用無(wú)菌水清洗。無(wú)菌條件下剪成5 mm×3 mm左右的組織塊，放在PDA培養(yǎng)基平板上，置于23℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。3～5 d后，觀察菌落生長(zhǎng)情況。用無(wú)菌接種環(huán)挑取組織塊周圍長(zhǎng)出的菌絲，在PDA上繼代培養(yǎng)分離菌株，直到獲得單一菌落。用直徑為1 cm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，浸入70%甘油，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

觀察菌落的大小、質(zhì)地、顏色和生長(zhǎng)速度等培養(yǎng)性狀，利用光學(xué)顯微鏡（YS100型，Nikon）觀察純化菌株的菌絲形態(tài)、孢子特征等顯微形態(tài)[14]，并且進(jìn)行分類、編號(hào)及保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原真菌DNA的提取

取培養(yǎng)4～6 d的菌絲體30 mg于2 mL離心管中，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（Sangon Biotech）提取病原菌基因組DNA，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

采用真菌rDNA-ITS的通用引物及G3PDH、HSP60、RPB2的特異性引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR自動(dòng)系列分析儀 Tpersonal型，Biometra）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq MasterMix 12.5 μL，0.1 mmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2。取5 μL PCR產(chǎn)物，60 V恒壓下在1%瓊脂糖凝膠中電泳50 min，凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-2500型，天能）觀察DNA擴(kuò)增情況。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序拼接

PCR產(chǎn)物由江蘇金唯智生物科技公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Codoncode Aligner軟件進(jìn)行拼接。

1.2.6 序列的同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

拼接后的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥blast.ncbi. Nlm. Nih.gov/）中對(duì)葡萄孢屬真菌的ITS、RPB2、HSP60和G3PDH序列進(jìn)行BLAST多序列比對(duì)。利用MEGA 10.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用1 000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的支持率，以支持率≥50%為閾值作為成功鑒別物種的界限[16]。

1.2.7 病原菌的致病性檢測(cè)

采用活體盆栽接種法：選6株健康的浙貝母植株，移栽到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用無(wú)菌土培養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境。將從病株上分離純化并培養(yǎng)了5 d的菌株打成直徑6 mm的菌餅兩個(gè)，加入到50 mL無(wú)菌水中，用滅菌玻璃棒將菌餅?zāi)胨?，使菌絲團(tuán)徹底散開(kāi)，每株浙貝母澆灌50 mL菌懸液。同時(shí)以接種空白PDA的植株為對(duì)照。根據(jù)分子鑒定結(jié)果，10個(gè)分離物為同一菌株，故設(shè)接菌和不接菌2個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3組。接種后的植株于室溫培養(yǎng)，觀察、記錄植株發(fā)病情況，并從發(fā)病部位再次分離病原真菌，確定分離得到的病菌是否為同一病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙貝母灰霉病的田間癥狀觀察

發(fā)病初期，浙貝母葉片上出現(xiàn)淡褐色的小斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大成橢圓形或不規(guī)則的黃褐色病斑，邊緣有明顯的水漬狀環(huán)，不斷擴(kuò)大形成灰色大斑，病株葉片略微黃色，有許多黑色斑塊。發(fā)病后期可見(jiàn)整個(gè)植株枯死（圖1）。潮濕時(shí)病部表層會(huì)產(chǎn)生大量的灰色霉層，上面分生孢子梗及分生孢子清晰可見(jiàn)。

2.2 病原真菌的顯微觀察

分離獲得10個(gè)真菌菌落，觀察各菌落在培養(yǎng)基上的形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)，均表現(xiàn)出葡萄孢盤(pán)菌屬真菌的顯著特征。菌落為近圓形，菌落正面內(nèi)圈為褐色，外圈為淡褐色，背面呈淡褐色（圖2）;菌落初期為灰白色，菌絲生長(zhǎng)旺盛，平均生長(zhǎng)速率約為12 mm/d，后期培養(yǎng)基邊緣長(zhǎng)出圓形的或者規(guī)則的灰黑色菌核，菌落表面也有菌核產(chǎn)生，并常伴有水珠樣分泌物;菌絲有隔，不規(guī)則分支，分生孢子梗清晰可見(jiàn)，分生孢子單生，球形或近球形，單孢（11.25～15.00）μm×（6.25～8.75）μm（平均13.13 μm×7.50 μm）。根據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為葡萄孢盤(pán)菌屬真菌[14]。

2.3 病原真菌DNA的PCR擴(kuò)增、測(cè)序、拼接及同源序列一致性比對(duì)

用真菌rDNA-ITS、RPB2、HSP60和G3PDH引物從10個(gè)分離物DNA中均成功獲得相應(yīng)序列。用Codoncode Aligner 軟件對(duì)各分離物的上述序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接及BLAST分析，發(fā)現(xiàn)這10個(gè)分離物的序列相同，為同一菌株。將序列上傳至GenBank獲得序列登錄號(hào)。分離物的ITS序列（登錄號(hào)：MN243672，521 bp）與GenBank中登錄號(hào)為KT279813的灰葡萄孢和登錄號(hào)為AB828687的富氏葡萄孢盤(pán)菌Botryotinia fuckeliana （灰葡萄孢的有性型）的一致性為100%;RPB2序列（登錄號(hào)：MN386055，1 143 bp）與登錄號(hào)為MG846509、KX867998的灰葡萄孢一致性為99.74%和登錄號(hào)為KJ018755的富氏葡萄孢盤(pán)菌一致性為99.46%;HSP60序列（登錄號(hào)：MN386077，1 022 bp）與登錄號(hào)為MK791187、MT233447、MH713609、MN159921的灰葡萄孢和登錄號(hào)為KC620329、JN692388富氏葡萄孢盤(pán)菌的一致性為99.80%;G3PDH序列（登錄號(hào)：MN386066，968 bp）與登錄號(hào)MN448500、MK791186、MK296119的灰葡萄孢和登錄號(hào)為KJ018759的富氏葡萄孢盤(pán)菌的一致性為99.90%。gzslib202204041314

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

基于ITS、RPB2、HSP60、G3PDH基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。分離物的ITS序列與GenBank中灰葡萄孢、富氏葡萄孢盤(pán)菌和水仙葡萄孢的有性型Botryotinia narcissicola[17]等3個(gè)葡萄孢盤(pán)菌屬真菌聚為一大支。分離物的RPB2基因序列先與灰葡萄孢及其有性型聚為一小支，然后與蔥腐葡萄孢Botrytis aclada聚為一支。分離物的HSP60基因序列與灰葡萄孢及其有性型聚為一支。分離物的G3PDH基因序列與灰葡萄孢及其有性型聚為一大支。因此，通過(guò)對(duì)各分離物ITS、RPB2、HSP60、G3PDH序列分析并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定分離物為灰葡萄孢。

2.5 病原菌的致病性檢測(cè)

經(jīng)致病性檢測(cè)，無(wú)菌土澆淋菌懸液1周后，浙貝母植株出現(xiàn)典型的灰霉病癥狀（圖4）：葉片褪綠發(fā)黃，葉片上有水浸狀斑塊。所以該分離物可引起浙貝母灰霉病，是引起浙貝母灰霉病的病原菌。

3 討論

以往多數(shù)報(bào)道認(rèn)為，浙貝母灰霉病由橢圓葡萄孢侵染所致[4，67，18]，但文獻(xiàn)資料均是通過(guò)病原真菌的菌落、菌絲體、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)學(xué)特性進(jìn)行鑒定，未見(jiàn)有利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。宗侃侃等認(rèn)為其致病菌可能為灰葡萄孢，但未提供分類鑒定的試驗(yàn)依據(jù)[1]。本實(shí)驗(yàn)室歷時(shí)數(shù)年從浙江省磐安縣采集浙貝母灰霉病病株，并經(jīng)多次分離純化，獲得了10株葡萄孢屬真菌，并首次采用國(guó)際通用的rDNA-ITS、HSP60、G3PDH和RPB2序列作為DNA條形碼結(jié)合致病性測(cè)定，證明了灰葡萄孢是浙貝母灰霉病的一種致病菌。

本實(shí)驗(yàn)室從2015年—2019年采集的浙貝母灰霉病病樣中均未獲得橢圓葡萄孢。究其原因，可能是由于橢圓葡萄孢的菌落、菌絲和孢子形態(tài)與葡萄孢盤(pán)菌的近緣種相似，以往觀察到的可能并非橢圓葡萄孢，或是由于種植方式、氣候、地域等條件的改變使浙貝母灰霉病的致病菌種類發(fā)生了變化。以往通過(guò)生物學(xué)特性研究，將同為百合科的百合灰霉病病原真菌鑒定為橢圓葡萄孢[1920]，但近年來(lái)利用DNA條形碼技術(shù)鑒定的結(jié)果證明，百合灰霉病的致病菌亦為灰葡萄孢[2122]。分子生物學(xué)技術(shù)避免了形態(tài)學(xué)鑒定方法不易區(qū)分近緣種的問(wèn)題，能更準(zhǔn)確地鑒定真菌的種類。橢圓葡萄孢是否為浙貝母灰霉病的致病菌仍有待于進(jìn)一步研究。

因此，本研究首次證實(shí)了浙貝母灰霉病的致病菌為灰葡萄孢，這為浙貝母灰霉病的流行學(xué)研究、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及防治奠定了基礎(chǔ)。

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