健脾益氣方治療猴免疫缺陷病毒感染獼猴的實驗研究

趙明亮 劉本波 丁雪 孟鵬飛 徐立然 田仁榮 鄭永唐

摘要：目的 評價健脾益氣方對正常實驗猴的影響及治療SIVmac239感染獼猴慢性期的作用效果。方法 4只正常實驗猴及8只SIVmac239病毒感染的實驗猴，隨機分為正常組、對照組、健脾益氣方治療組3組。檢測不同時期健脾益氣方對正常實驗猴和感染猴的體重、血常規(guī)、血生化、血漿病毒載量以及CD4+ T細胞和CD8+ T細胞計數(shù)及各亞群的變化情況。結(jié)果 健脾益氣方對正常實驗猴的常規(guī)生理指標影響較小，其中白細胞計數(shù)和血小板計數(shù)與干預開始前相比逐漸降低（P<0.05），但均在非人靈長類動物血常規(guī)檢測指標的參考范圍之內(nèi)。對照組血小板計數(shù)在實驗期間顯著降低（P<0.05），健脾益氣方治療組也有降低但差異不顯著（P>0.05），均在正常參考范圍之內(nèi)。對照組血漿病毒載量與治療前相比升高了1.01 log10 copies/mL，治療組升高了1.48 log10 copies/mL，但無顯著性差異（P>0.05）。對照組CD4/CD8細胞比值在實驗期間逐漸降低（P<0.05），但治療組無此現(xiàn)象;其中治療組在治療8周時CD4/CD8細胞比值明顯高于對照組（P<0.05）。治療組在各治療時間點CD38+CD4+ T細胞百分比和CD38+CD8+ T細胞百分比均高于對照組，組間無顯著性差異（P>0.05），均維持相對穩(wěn)定。治療組nave CD4+ T細胞百分比及nave CD8+ T細胞百分比在各治療時間點均高于對照組，但無顯著性差異（P>0.05）。 結(jié)論 健脾益氣方對正常實驗猴的一般生理參數(shù)影響較小;對SIVmac239感染實驗猴血常規(guī)指標影響也較小;對病毒感染慢性期的腎損傷可能有保護作用;對實驗猴血漿病毒載量無明顯抑制作用;但可提高CD4/CD8細胞比值、CD4+ T細胞和CD8+T細胞活化以及T細胞亞群百分比發(fā)揮免疫功能。

關(guān)鍵詞：健脾益氣方，猴免疫缺陷病毒，獼猴，免疫功能，動物模型

中圖分類號：R285.5??; 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）03-0071-07

人類免疫缺陷病毒（HIV）是一種包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染HIV病毒可導致獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS），HIV病毒進入人體后2至4周，患者可能會出現(xiàn)原發(fā)感染的相關(guān)癥狀[1]。HIV可分為HIV-1和HIV-2，HIV-1在全球范圍內(nèi)更廣泛，毒性更強。HIV病毒結(jié)合T淋巴細胞表面的CD4分子和CCR5（趨化因子共受體）受體與細胞膜融合，從而進入輔助T淋巴細胞。在與宿主基因組整合形成HIV原病毒，然后進行轉(zhuǎn)錄和病毒mRNA的生產(chǎn)。HIV是在宿主細胞中進行結(jié)構(gòu)蛋白制造和組裝，然后從宿主細胞出芽釋放病毒粒子感染其他細胞[2]。截至2019年底，全球現(xiàn)存活HIV/AIDS患者約為3800萬例[3]。隨著HAART治療的不斷推廣，艾滋病已經(jīng)成為可控的慢性傳染性疾病，發(fā)病率和死亡率大大降低[4-5]。然而，當前HAART治療仍然存在包括藥物副作用、成本收益、治療依從性、病毒學失敗、耐藥等方面的問題[6-7]。因此，尋找新方法和有效藥物成為目前艾滋病治療研究的新領(lǐng)域。

健脾益氣方是由河南省中藥研究院根據(jù)中醫(yī)辨證論治原則針對于艾滋病患者免疫功能低下所研制出的一種提免疫中藥制劑[8]。它的功效主要為益氣健脾，養(yǎng)血護胃，解毒功效，能增加機體免疫功能[9]。獼猴（Rhesus macaques，RM）感染猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）已被廣泛用作HIV/AIDS研究的一個成熟的非人靈長類動物模型。越來越多的研究使中國RM來評估SIV感染的免疫發(fā)病機制[10]。本研究采用SIVmac239感染獼猴評價健脾益氣方治療SIV感染獼猴的效果實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及毒株 中國獼猴12只，雄性，體重7.6～9.9 kg，年齡5～6歲，毛色正常，精神狀態(tài)健康，經(jīng)檢測無SIV，STLV（猴T淋巴細胞病毒），SRV（猴逆轉(zhuǎn)錄病毒），BV（細菌性陰道病），CMV（巨細胞病毒）五種病原。實驗動物由中國科學院昆明動物研究所靈長類動物中心提供，實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境干凈、整潔、無噪音、采光正常、夜晚關(guān)燈、給予猴糧及水果飼喂，確保整個飼養(yǎng)環(huán)境對實驗猴的正常生理活動無不良影響。實驗獲得中國科學院昆明動物研究所倫理學委員會批準（批準號：IACUC18010）。SIVmac239病毒由本實驗室培養(yǎng)保存。

1.2 主要試劑 舒泰50（FeiBo）、小牛血清（gibco）、Ficoll-PaqueTM PREMIUM（GE）、DMSO（SIGMA）、1×PBS、0.9%生理鹽水、Fixation and Permeabilization Solution（BD）、10×Lysing Buffer（BD）、BD Trucount Tubes、10×RBC Lysis/Fixation Solution（BD）、CST beads（BD）、Perm/Wash Buffer（BD）、High Pure Viral RNA Kit試劑盒（Roche）、RNA-directTM Realtime PCR Master Mix（Toyobo）、流式抗體APC-Cy7 CD3（SP34-2）、PerCp-cy5.5 CD4（OKT4）、PE-Cy7 CD8（RPA-T8）、APC CD14（M5E2）、FITC CD20（2H7）APC HLA-D（L243）、FITC CD38（AT-1）、PE PD-1（EH12.1）、PE Ki67（B56）、APC CD28（CD28.2）、FITC CD95（DX2）購自美國BD公司。

1.3 主要儀器 電子天平、BC-2800Vet獸用全自動血液細胞分析儀（邁瑞）、Applied Bio systems 7500 Fast Real-Time PCR System定量PCR儀（ABI，美國）、超純水儀（Millipore）、BDverse流式細胞分析儀（BD）、二級生物安全柜（Thermo Fisher）、常溫冰箱（Haier）。

1.4 實驗藥物 健脾益氣方是由河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，以人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、當歸、川芎、白芍、黃芩等以君臣配伍而成。

1.5 動物分組及處理方法 12只獼猴隨機分為正常組、對照組和治療組（健脾益氣方藥物用量為1.08 g/kg，相當于臨床的等效劑量）3組，每組4只。對照組和治療組均靜脈注射SIVmac239病毒（病毒滴度為1×103 TCID50）建立SIV感染動物模型。感染18周后進行健脾益氣方治療。用電子天平精確稱取每只猴所需藥粉量，分別將藥粉與繁殖飼料按1∶10的比例混合均勻，對照組給予等量繁殖飼料，每日1次，治療24周。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 血常規(guī)檢測 采用BC-2800 Vet獸用全自動血液細胞分析儀檢測外周血常規(guī)指標。

1.6.2 血生化檢測 血生化指標檢測為ALT、AST、AST/ALT、Cr、GGT、LDH，并委托昆明金域醫(yī)學檢驗所有限公司進行檢測。

1.6.3 免疫指標檢測 采用BDverse流式細胞分析儀檢測全血中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞計數(shù)、免疫活化及各亞群比率。

1.6.4 血漿病毒載量檢測 采集實驗猴全血分離血漿，提取血漿中病毒RNA，采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System定量PCR儀檢測血漿病毒載量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0軟件（IBM公司，美國）進行分析。數(shù)據(jù)描述使用其均數(shù)、標準差并以（x±s）表示，2組數(shù)據(jù)之間的差異采用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney檢驗），多配對數(shù)據(jù)的差異采用非參數(shù)檢驗（Friedman檢驗），P<0.05認為差異顯著;流式數(shù)據(jù)使用FlowJo VX版本進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 健脾益氣方對正常猴常規(guī)生理指標的影響 4只正常猴給藥健脾益氣方后進行了持續(xù)的日常觀察，在給藥期間正常猴的飲食、毛發(fā)、精神狀態(tài)、排泄物以及活動能力均維持正常狀態(tài)。檢測了在健脾益氣方給藥前、給藥8、16、24周正常猴的體重、6項血常規(guī)指標及6項血生化指標;其中體重、淋巴細胞計數(shù)、淋巴細胞比率、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及乳酸脫氫酶在研究期間均未呈現(xiàn)出顯著性變化（P>0.05）。白細胞計數(shù)和血小板計數(shù)與給藥前相比逐漸降低（P<0.05），但均在非人靈長類動物血常規(guī)檢測指標的參考范圍之內(nèi)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶在干預24周時升高（P<0.05）（表1）。其中4只動物中的1只動物谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測值較高，同時健脾益氣方對正常猴也未顯示出過敏癥狀。綜上可知，研究結(jié)果表明健脾益氣方的安全性較好。

2.2 健脾益氣方對SIVmac239感染獼猴體重及血液常規(guī)參數(shù)的影響 兩個實驗組在治療前和治療后4、8、16、24周體重及血常規(guī)參數(shù)：兩個實驗組的體重、白細胞、淋巴細胞計數(shù)、淋巴細胞比率、紅細胞計數(shù)及血紅蛋白在組內(nèi)各時間點之間沒有顯著差異（P>0.05）。對照組血小板計數(shù)在實驗期間顯著降低（P<0.05），治療組也有降低但差異不顯著（P>0.05），均在正常參考范圍之內(nèi)。兩個實驗組在相同時間點的體重、白細胞、淋巴細胞計數(shù)、淋巴細胞比率、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白及血小板組間沒有顯著差異（P>0.05）（表2）。研究表明健脾益氣方對SIVmac239感染實驗猴血常規(guī)指標影響較小。

2.3 健脾益氣方對SIVmac239感染獼猴血生化參數(shù)的影響 兩個實驗組在治療前和治療后4、8、16、24周血生化參數(shù)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在組內(nèi)各時間點之間沒有顯著差異（P>0.05）。對照組肌酐在組內(nèi)各時間點逐漸升高（P<0.05），但治療組無此現(xiàn)象;對照組和治療組乳酸脫氫酶均在組內(nèi)逐漸降低（P<0.05），臨床診斷肌酐升高說明腎功能出現(xiàn)了損傷，乳酸脫氫酶降低沒有臨床意義。兩個實驗組在相同時間點的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐及乳酸脫氫酶組間沒有顯著差異（P>0.05），γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在治療16周時低于對照組（P<0.05）（表3）。表明健脾益氣方對SIVmac239感染實驗猴慢性期的腎損傷可能有保護作用。

2.4 健脾益氣方對SIVmac239感染獼猴外周血中病毒載量的影響 兩個實驗組的血漿病毒載量在實驗期間組間和組內(nèi)均無顯著性差異（P>0.05），基本保持穩(wěn)定并略有升高。對照組與治療前相比升高了1.01 log10 copies/mL，治療組升高了1.48 log10 copies/mL，但無顯著性差異（P>0.05）。表明健脾益氣方對實驗猴的血漿病毒載量無抑制作用，但可能會起到穩(wěn)定病毒載量的作用。見表4。

2.5 健脾益氣方對SIVmac239感染獼猴外周血中免疫細胞的影響 兩個實驗組的CD4+ T細胞計數(shù)和CD8+ T細胞計數(shù)在實驗期間組間均無顯著性差異（P>0.05），其中CD8+ T細胞計數(shù)在治療8周時治療組明顯低于感染組（P<0.05）;對照組CD4/CD8細胞比值在實驗期間逐漸降低（P<0.05），但治療組無此現(xiàn)象;其中治療組在治療8周時CD4/CD8細胞比值明顯高于對照組（P<0.05）;治療組在各治療時間點CD38+CD4+ T細胞百分比均高于對照組，組間無顯著性差異（P>0.05），均維持相對穩(wěn)定;治療組CD38+CD8+ T細胞百分比在治療16周時與治療前相比升高了17.57，同時治療組在各治療時間點CD38+CD8+ T細胞百分比均高于對照組，組間無顯著性差異（P>0.05），對照組CD38+CD8+ T細胞百分比組內(nèi)無差異（P>0.05）;治療組nave CD4+ T細胞百分比及nave CD8+ T細胞百分比在各治療時間點均高于對照組，但無顯著性差異（P>0.05），詳見表5。實驗結(jié)果表明健脾益氣方可提高CD4/CD8細胞比值、CD4+ T細胞和CD8+ T細胞活化以及T細胞亞群的百分比發(fā)揮免疫功能。

3 討論

艾滋病在中醫(yī)基礎理論的范疇中，可歸于中醫(yī)“疫病”“伏氣溫病”“虛勞”等，是長期虛勞內(nèi)損，艾滋病病毒侵襲機體造成正氣虛弱，元氣損耗，致使免疫系統(tǒng)受損，逐漸發(fā)展為艾滋病[9-11]。目前在中醫(yī)藥艾滋病防治領(lǐng)域，單味中藥的有效成分及中藥復方在艾滋病防治方面也有越來越多的應用。唐草片是中國首個批準用于治療艾滋病的中成藥[12]，在臨床中使用的其它中藥主要還有艾可清膠囊[13]、太芪培元顆粒[14]、益艾康膠囊[15]、艾靈顆粒[16]、康愛保生丸[17]等，臨床研究發(fā)現(xiàn)很多復方藥物都能夠提高患者的免疫力，改善患者的臨床癥狀，對艾滋病患者具有一定的臨床療效[11]。

臨床研究表明益艾康膠囊可明顯提高HIV感染者CD3+T、CD4+ T淋巴細胞計數(shù)，可能與延緩病毒在CD4+ T淋巴細胞內(nèi)復制以及促進T細胞增殖相關(guān)[18]，同時能有效減緩無癥狀期HIV感染者CD4+ T淋巴細胞亞群的減少[19]。益艾康含藥血清還能能顯著促進NK-92MI細胞增殖，增強NK-92MI細胞毒功能[20]。本研究首次應用非人靈長類艾滋病動物模型，探究健脾益氣方對正常實驗猴、SIV感染猴的常規(guī)生理指標，抗病毒作用以及免疫功能等方面的影響并進行評價研究。研究結(jié)果表明健脾益氣方對正常實驗猴的常規(guī)生理指標影響較小，對SIVmac239感染實驗猴慢性期的腎損傷可能有保護作用，但對實驗猴血漿病毒載量無抑制作用，同時可提高CD4/CD8細胞比值、CD4+ T細胞和CD8+ T細胞活化以及細胞亞群的比率發(fā)揮免疫功能。

雖然中藥治療艾滋病具有一定的臨床療效，但目前針對艾滋病的治療依然是以抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物為主，但抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物也存在毒副作用、耐藥、合并用藥以及經(jīng)濟成本等問題。有研究表明中藥與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合治療可降低抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的副作用，增強機體免疫功能，促進抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療效[21-28]。因此，可結(jié)合中藥與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物對艾滋病患者進行聯(lián)合治療，在抗病毒的同時恢復機體免疫功能，并減輕抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的副作用，使患者的依從性得以提高，促進治療效果。根據(jù)患者體征的異同，可用不同的中西醫(yī)診療方案，對艾滋病進行精準醫(yī)療，提高艾滋病患者的存活率及生活質(zhì)量。此外應建立合適的中西藥聯(lián)合治療艾滋病動物模型，以評價中西藥臨床前療效，為臨床運用中西藥聯(lián)合治療艾滋病提供數(shù)據(jù)參考。總體而言，中西藥具有潛在治療或輔助治療艾滋病的優(yōu)勢并在未來具有廣闊前景。

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（收稿日期：2021-09-01）