益氣養(yǎng)陰活血方改善2型糖尿病大鼠胰島分泌功能的作用機(jī)制

王順意　張軍　劉穎　陳偉　魏錦花　王保蒼　劉文超

摘要目的：探討益氣養(yǎng)陰活血方改善2型糖尿?。═2DM）大鼠胰島分泌功能的作用機(jī)制。方法：選取無特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠66只，隨機(jī)分為對(duì)照組11只及造模組55只。造模組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素建立T2DM模型，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)及等體積0.1 mmol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液。造模成功的大鼠分為模型組、益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組及西藥組，每組11只。模型組及對(duì)照組給予蒸餾水，益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組給予0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL益氣養(yǎng)陰活血方;西藥組予以20 mg/mL二甲雙胍懸液;各組灌胃劑量10 mL/kg，1次/d，連續(xù)12周。檢測比較空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、胰島素分泌指數(shù)（HOMAβ）、胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰島微小核糖核酸375（miR375）及B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl2）、胱天蛋白酶3（Caspase3）表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，各組FBG水平、胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰島組織miR375及Caspase3表達(dá)水平較低，F(xiàn)INS、HOMAβ水平及胰島組織Bcl2表達(dá)水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且益氣養(yǎng)陰活血方組呈一定量效關(guān)系。結(jié)論：益氣養(yǎng)陰活血方能劑量依賴性的降低T2DM大鼠血糖，改善胰島分泌功能，抑制胰島細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制胰島組織miR375表達(dá)，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Caspase3表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞益氣養(yǎng)陰活血方;2型糖尿病;鏈脲佐菌素;微小核糖核酸375;空腹血糖;胰島分泌功能;胰島細(xì)胞凋亡;胱天蛋白酶3

Mechanism of Yiqi Yangyin Huoxue Formula on Improving Islet Secretion Function in Type 2 Diabetic Rats

WANG Shunyi，ZHANG Jun，LIU Ying，CHEN Wei，WEI Jinhua，WANG Baocang，LIU Wenchao

（1 Department of Rheumatism，Immunology and Metabolism，Tangshan Hospital of traditional Chinese Medicine，Tangshan 063000，

China; 2 The First Department of Endocrinology，Tangshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Tangshan 063000，China）

AbstractObjective：To explore the mechanism of Yiqi Yangyin Huoxue Formula on improving islet secretion function in rats with type 2 diabetes mellitus（T2DM）.Methods：A total of 66 SPF male SD rats were selected，and were randomly divided into a control group with 11 rats and a model building group with 55 rats.The model was fed with highsugar and highfat feed combined with streptozotocin to establish a T2DM model.The control group was fed with standard pellet feed and an equal volume of 0.1 mmol/L citric acidsodium citrate buffer.The successfully modeled rats were divided into a model group，a low，medium and high concentration group of Yiqi Yangyin Huoxue Formula，and the Western medicine group，each with 11 rats.The model group and the control group were given distilled water，the low，medium and high concentration groups of Yiqi Yangyin Huoxue Formula of 0.43 g/mL，0.86 g/mL，1.72 g/mL; the Western medicine group was given 20 mg/mL metformin suspension; the intragastric dose of each group was 10 mL/kg，once a day，for 12 consecutive weeks.Fasting blood glucose（FBG），fasting insulin（FINS），insulin secretion index（HOMAβ），islet cell apoptosis index，islet microribonucleic acid375（miR375） and B lymphoma2（Bcl2） The expression level of Caspase3 containing cysteine were tested and compared.Results：Compared with the model control group，the levels of FBG，apoptotic index of islet cells，miR375 and Caspase3 expression levels in islet tissues were lower，the levels of FINS and HOMAβ，and Bcl2 expression levels in islet tissues were higher in each group，the differences were all statistically significant（P<0.05），and Yiqi Yangyin Huoxue Formula group showed a certain dose effect relationship.Conclusion：Yiqi Yangyin Huoxue Formula can reduce blood sugar level in rats with type 2 diabetes mellitus in a dosedependent manner，improve islet secretion function and inhibit islet cell apoptosis，the effect may be related to inhibiting the expression of miR375 in islet tissue，and then regulating the expression of apoptosisrelated proteins Bcl2 and Caspase3.

KeywordsYiqi Yangyin Huoxue Formula; Type 2 diabetes mellitus; Streptozotocin; Microribonucleic acid375; Fasting blood glucose; Islet secretion function; Islet cell apoptosis; Cysteinecontaining aspartate proteolytic enzyme3

中圖分類號(hào)：R289.5;R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.007

2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）是由于胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏導(dǎo)致的以碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝異常為特點(diǎn)的臨床綜合征，屬于內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)最常見的疾病之一[1]。T2DM在45歲以上中老年人群高發(fā)，國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）有資料稱[2]，至2014年，全球糖尿患者已達(dá)3.87億，T2DM占到85%～95%，我國目前為糖尿病第一大國，發(fā)病率約11.6%[3]，而且逐年增加并有年輕化趨勢。T2DM已經(jīng)成為重大的公共健康問題，目前尚無根治方法，除胰島素外，臨床上主要采用二甲雙胍、磺脲類藥物、α葡萄糖苷酶、格列奈類藥物、噻唑烷二酮類等口服藥物來控制血糖水平[4]。但是，上述藥物并不能從根本上阻止病情進(jìn)展，隨著T2DM發(fā)病機(jī)制的研究日益深入，相關(guān)新藥研發(fā)成為研究的熱點(diǎn)，中醫(yī)藥以其安全、有效的優(yōu)點(diǎn)成為新藥研究的主要方向。益氣養(yǎng)陰活血法是中醫(yī)治療T2DM的主要療法之一，劉波[5]研究顯示，益氣養(yǎng)陰活血法治療T2DM的臨床療效理想且安全性高，但具體到某中藥復(fù)方還須進(jìn)行深入研究。本研究主要探討益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)T2DM大鼠胰島分泌功能及微小核糖核酸375（miR375）表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物選取6～8周無特殊病原體（SPF）級(jí)健康SD大鼠66只，均為雄性，體質(zhì)量170～210 g，平均體質(zhì)量（192.12±9.15）g，購自賽業(yè)模式生物研究中心（太倉）有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）20180003。所有大鼠每籠4只飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將溫度控制在20～22 ℃，濕度控制在50%～60%，光照時(shí)間為6：00—18：00，安靜、通風(fēng)，大鼠在籠內(nèi)自由活動(dòng)并攝入標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及蒸餾水，每周打掃鼠籠3次、更換墊料并消毒。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：20180119。

1.1.2藥物益氣養(yǎng)陰活血方，藥物組成：黃芪20 g，麥冬、茯苓、女貞子、墨旱蓮、葛根、玄參各15 g，白術(shù)、山萸肉、知母、川芎各12 g，五味子、紅花各10 g，桃仁9 g，深州市鑫旺中藥飲片有限公司生產(chǎn)，加水浸泡30 min后煎煮2次，混合濃縮并配制成生藥劑量為0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL益氣養(yǎng)陰活血方藥液，4 ℃保存?zhèn)溆?。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180521）規(guī)格：0.5 g/片，研末后用蒸餾水配制成劑量為20 mg/mL二甲雙胍懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.2試劑與儀器鏈脲佐菌素（STZ）（常州貝源鑫生物科技有限公司，貨號(hào)：BYX455A）;高糖高脂飼料（上海銳賽生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RD12492）;大鼠空腹胰島素（FINS）ELISA試劑盒（深圳市安提生物科技有限公司，貨號(hào)：AT0689EL1）;TUNEL檢測試劑盒（FITC標(biāo)記POD法）（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：KGA703）;miR375引物、U6引物（赫澎（上海）生物科技有限公司，貨號(hào)：HEPENGBIOTG624;HEPENGBIOTG596）;TRIzol法總RNA提取試劑盒（南京賽泓瑞生物科技有限公司，貨號(hào)：R683401）;兔抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl2）、胱天蛋白酶3（Caspase3）、肌動(dòng)蛋白（βactin）單克隆抗體（武漢益普生物科技有限公司，貨號(hào)：ATA25316;ATA25878;ATA40111）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，貨號(hào)：zk2896）;磷酸鹽緩沖液（PBS）、TBST緩沖液（上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司，貨號(hào)：AS16049;N/A429），購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）配制試劑盒（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：hz37021）;超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒[愛必信（上海）生物科技有限公司，貨號(hào)：abs920]。全自動(dòng)化分析儀（BECKMAN CLOUTER公司，美國，型號(hào)：LX20）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號(hào)：Multiskan Sky）;熒光顯微成像系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號(hào)：EVOS M7000）;微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號(hào)：Multiskan Sky）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號(hào)：ABI 7500）;電泳儀（Biometra公司，德國，型號(hào)：Compact L）;凝膠成像系統(tǒng)（UVItec公司，英國，型號(hào)：Alliance Chroma）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備經(jīng)過5 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠分為對(duì)照組11只及造模組55只。造模組飼以高糖高脂飼料，對(duì)照組飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，2周后，造模組給予1%鏈脲佐菌素（STZ）溶液（采用pH值為4.2～4.4的0.1 mmol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液溶解STZ配制而成）30 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組給予等體積0.1 mmol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射;繼續(xù)按照原方案飼養(yǎng)大鼠，1周后，測定大鼠隨機(jī)血糖，若隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，即為成功建立2型糖尿病大鼠模型，此次造模組所有大鼠均建立模型成功[6]。然后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組及西藥組，每組11只。

1.2.2給藥方法模型組、益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組及西藥組繼續(xù)飼以高糖高脂飼料，對(duì)照組繼續(xù)飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。模型組及對(duì)照組分別給予蒸餾水10 mL/kg，1次/d，灌胃;益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組給予0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL益氣養(yǎng)陰活血方藥液10 mL/kg，1次/d，灌胃;西藥組給予20 mg/mL二甲雙胍懸液10 mL/kg，1次/d，灌胃。所有大鼠均連續(xù)給藥12周。

1.2.3檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1標(biāo)本采集與處理藥物干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，斷頭采血4 mL，室溫靜置30 min，以1 000×g，離心力離心10 min，制備血清，-20 ℃保存;完整摘取大鼠胰腺組織，取1/2胰腺組織采用4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制備4 μm石蠟切片，以備TUNEL檢測;剩余1/2胰腺組織采用液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，以RTPCR及Western blotting檢測[7]。

1.2.3.2大鼠血清生化指標(biāo)及胰島分泌功能檢測取出1.2.3.1中制備的血清，緩慢融化恢復(fù)至室溫，采用全自動(dòng)生化分析儀，通過酶法測定空腹血糖（FBG）水平;采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定血清空腹胰島素（FINS）水平[8]。胰島素分泌指數(shù)（HOMAβ）=20×FINS（mIU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5]×100%，計(jì)算HOMAβ。

1.2.3.3TUNEL染色法觀察大鼠胰島細(xì)胞凋亡情況取出步驟1.2.2中制備的胰腺組織石蠟切片→常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇水合→PBS漂洗3 min×2次→室溫下，蛋白酶K工作液處理切片30 min→PBS漂洗3 min×2次→室溫下，3%過氧化氫甲醇溶液封閉10 min→PBS漂洗3 min×2次→采用TUNEL試劑盒對(duì)切片進(jìn)行標(biāo)記、顯色→PBS漂洗3 min×3次→蘇木精染液復(fù)染3 min→常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片[9]。在200倍熒光顯微成像系統(tǒng)下觀察染色結(jié)果：正常細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞核被染成綠色;每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野采集圖像，用Image J圖像處理軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，5個(gè)視野平均值即為凋亡指數(shù)。

1.2.3.4RTPCR法檢測大鼠胰腺組織miR375表達(dá)情況取出步驟1.2.3.1中凍存的胰腺組織50 mg→剪碎后充分勻漿→按照試劑盒說明，采用TRIzol法提取總RNA→用微量分光光度計(jì)確定RNA樣本的濃度和及純度→分別以miR375、內(nèi)參U6 RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成相應(yīng)的特異cDNA第一鏈→避光建立擴(kuò)增反應(yīng)體系（cDNA 2 μL+上游引物1 μL+下游引物1 μL+熒光染料SYBR Green 10 μL+焦碳酸二乙酯水6 μL）→采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，獲得miR375、內(nèi)參U6 RNA擴(kuò)增曲線和溶解曲線[9]。根據(jù)擴(kuò)增曲線分析miR375及內(nèi)參U6 RNA的Ct值，根據(jù)2-△△Ct方法，采用公式△△Ct=觀察組（目的基因Ct值-內(nèi)參U6 Ct值）+對(duì)照組（目的基因Ct值-內(nèi)參U6 Ct值），計(jì)算miR375的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3.5Western blotting法檢測大鼠胰腺組織Bcl2、Caspase3表達(dá)水平取出步驟1.2.3.1中凍存的胰腺組織→剪碎后加入組織蛋白裂解液200 μL于冰上勻漿20 min→4 ℃條件下[9]，以12 000×g離心力離心15 min→采用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒檢測上清液中總蛋白水平以確定上樣量→按照試劑盒說明配制SDSPAGE凝膠，灌注于電泳裝置上→上樣→電泳（5%濃縮膠80 V，10%分離膠100 V）分離目的蛋白→轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上→室溫下，5%封閉液封閉1 h→TBST漂洗5 min×3次→4 ℃條件下，Bcl2（1：200稀釋）、Caspase3（1∶200稀釋）、βactin（1∶500稀釋）一抗工作液孵育過夜→TBST漂洗5 min×3次→室溫下，羊抗兔二抗（1∶1 000稀釋）工作液孵育1 h→TBST漂洗5 min×3次→采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒使蛋白條帶顯影，然后曝光、定影。采用Alliance Chroma型凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行掃描并拍照，分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算Bcl2、Caspase3相對(duì)βactin的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)性的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSDt檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠FBG、FINS、HOMAβ水平比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠FBG水平明顯升高，F(xiàn)INS、HOMAβ水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠FBG水平均較低，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組和西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠FINS、HOMAβ水平均較高，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組<益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組<益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組和西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2各組大鼠胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)較低，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組和西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖1。

2.3各組大鼠胰腺組織miR375表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠胰腺組織miR375表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠胰腺組織miR375表達(dá)水平均較低，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組和西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3，圖2～5。

2.4各組大鼠胰腺組織Bcl2、Caspase3表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠胰腺組織Bcl2表達(dá)水平顯著降低，Caspase3表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠胰腺組織Bcl2表達(dá)水平較高，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組<益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組<益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組和西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠胰腺組織Caspase3表達(dá)水平較低，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組>益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組和西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4，圖6。

3討論

T2DM的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且尚未完全清楚，遺傳、代謝、免疫異常、炎癥反應(yīng)等多種因素均參與其發(fā)生發(fā)展過程，深入研究其發(fā)病機(jī)制有助于尋找新的治療靶點(diǎn)，為T2DM的新藥尋找提供方向和依據(jù)。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生中扮演重要角色。微小RNA屬于非編碼單鏈RNA，僅含有22個(gè)核苷酸序列，能夠直接結(jié)合并調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[1011]?？姾槭|等[12]研究發(fā)現(xiàn)，特異性miRNA可以直接通過調(diào)節(jié)代謝紊亂、B細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等，參與T2DM的發(fā)病過程，可作為T2DM治療的新靶點(diǎn)進(jìn)行探討。中醫(yī)認(rèn)為，該病屬于“消渴病”范疇[13]，根本病機(jī)為肺、脾、腎陰虛燥熱，耗傷氣津，氣陰兩虛，血行不暢，久之成瘀，發(fā)為本病，治療上應(yīng)以益氣養(yǎng)陰為主，兼以活血。本研究針對(duì)T2DM的中醫(yī)病機(jī)，采用益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)T2DM模型大鼠胰島分泌功能的影響，并通過研究miR375表達(dá)情況，探討其作用機(jī)制。

益氣養(yǎng)陰活血方方中黃芪味甘，性微溫，可補(bǔ)氣固表，利尿消腫，山萸肉味酸、澀，性微溫，能補(bǔ)益肝腎，收澀固脫，二者健脾益氣、滋養(yǎng)肝腎，共為君藥;茯苓味甘、淡，性平，善健脾滲水利濕，白術(shù)味苦、甘，溫，有健脾益氣，燥濕利水之效，麥冬味甘、微苦，性微寒，可瀉熱生津解渴，葛根味甘，性辛涼，能生津止渴，五味子味酸、甘，性溫，善滋腎，生津，收汗，女貞子味甘、苦，性平，可補(bǔ)益肝腎，滋陰益壽，墨旱蓮味甘酸，性涼，有涼血，補(bǔ)腎，益陰之功，這幾味藥既能助君藥益氣健脾，又能養(yǎng)陰生津止渴，共為臣藥;再加上桃仁、紅花活血祛瘀，川芎行氣活血，玄參、知母清肺、涼胃、瀉腎，使補(bǔ)而不滯，同行三焦，共為佐使;全方藥物配伍，三焦并補(bǔ)，以泄助補(bǔ)，共奏益氣養(yǎng)陰，活血通瘀之效。現(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪中含有黃芪總酮、黃芪總多糖等活性成分，能夠通過增強(qiáng)胰島素敏感性、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等作用防治糖尿病[14];麥冬中的有效成分主要為麥冬多糖、甾體皂苷等，有較好的降血糖作用[15]。

本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射，使得模型組大鼠血糖水平升高，胰島素分泌減少，成功建立了T2DM大鼠模型。各組經(jīng)不同劑量益氣養(yǎng)陰活血方和二甲雙胍干預(yù)后，大鼠FBG水平低于模型組，F(xiàn)INS、HOMAβ水平高于模型組，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組和西藥組較模型組差異最為明顯，表明益氣養(yǎng)陰活血方可以有效控制T2DM大鼠血糖水平，改善胰島細(xì)胞的分泌功能，防治病情進(jìn)展，而且藥物劑量越大，作用效果越好。

本研究從對(duì)miR375及胰島細(xì)胞凋亡調(diào)控方面探討作用機(jī)制。胰島B細(xì)胞是機(jī)體胰島素的唯一來源，分泌功能異常是引起胰島素不足的主要原因，有研究認(rèn)為，在T2DM患者中，B細(xì)胞凋亡增多，正常細(xì)胞數(shù)量減少是分泌功能缺陷的關(guān)鍵，干預(yù)B細(xì)胞凋亡在T2DM的治療中有重要意義[16]。miR375是胰腺特異性微小RNA之一[17]，參與糖脂代謝、胰腺生長發(fā)育及功能維持等過程。曹月等[18]的體外研究顯示，miR375能夠通過特異性的抑制早老素1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)大鼠胰島B細(xì)胞系INS1細(xì)胞凋亡。下調(diào)內(nèi)源性miR375表達(dá)，則有助于抑制NIT1胰島B細(xì)胞脂性凋亡。楊慶宇和郜娜[19]的研究提示，糖尿病小鼠胰島組織中miR375呈過表達(dá)狀態(tài)，其可能通過調(diào)節(jié)抑制Bcl2表達(dá)，促進(jìn)Caspase3表達(dá)來誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡。本研究中，各組大鼠胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)及胰島組織Caspase3表達(dá)水平均低于模型組，Bcl2表達(dá)水平高于模型組，且益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組和西藥組變化最明顯，表明高劑量益氣養(yǎng)陰活血方能有效調(diào)控miR375及關(guān)蛋白Bcl2、Caspase3表達(dá)，抑制胰島細(xì)胞凋亡，這可能是益氣養(yǎng)陰活血方改善胰島分泌功能，治療T2DM的作用機(jī)制之一。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰活血方能劑量依賴性地降低T2DM大鼠血糖水平，改善胰島分泌功能，抑制胰島細(xì)胞凋亡，其作用可能與抑制胰島組織miR375表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Caspase3表達(dá)有關(guān)。

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（2020-08-10收稿本文編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2017129）

作者簡介：王順意（1988.11—），女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療糖尿病，Email：ktene3@163.com

通信作者：張軍（1968.06—），女，碩士，主任中醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥治療糖尿病，Email：tszhangj@126.com