穴位埋線對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型大鼠慢性炎癥的療效評價(jià)

李慧禎　童麗　陳秀萍　李永平　孫文萍

摘要目的：探討穴位埋線對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOSIR）模型大鼠的療效。方法：將48只雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、二甲雙胍組和穴位埋線組，每組8只。除正常組外，其余各組以項(xiàng)背部皮下注射脫氫表雄酮建立PCOSIR模型。按照每組治療方案進(jìn)行干預(yù)，共28 d。借助HE染色對卵巢組織形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法對血清空腹胰島素（FINS）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、黃體生成素（LH）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）和睪酮（T）進(jìn)行定量，通過相關(guān)公式計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）和游離雄激素指數(shù)（FAI）值。結(jié)果：與正常組比較，模型組卵巢組織黃體、正常卵泡少見，閉鎖卵泡數(shù)增多，閉鎖卵泡內(nèi)見大量的顆粒細(xì)胞核固縮、崩解，顆粒層細(xì)胞被擠壓至邊緣，排列無序，見大量囊樣擴(kuò)張卵泡，且大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR、CRP、LH、T及FAI水平顯著升高（P<0.01），SHBG水平降低（P<0.05）。與模型組比較，各觀察組卵巢中黃體量增多，囊泡及閉鎖卵泡減少，顆粒層細(xì)胞規(guī)律排列，尤其聯(lián)合組各級卵泡數(shù)量及發(fā)育接近正常，未見囊樣改變的卵泡，且大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR、CRP、T、FAI、LH水平均顯著降低（P<0.01），SHBG水平升高（P<0.05）。結(jié)論：穴位埋線可以改善PCOSIR模型大鼠性激素水平、胰島素抵抗（IR）及慢性炎癥狀態(tài)，該療法方便簡潔、安全性高、不良反應(yīng)少，值得臨床推廣。

關(guān)鍵詞穴位埋線;多囊卵巢綜合征;胰島素抵抗;慢性炎癥;C反應(yīng)蛋白;游離雄激素指數(shù);性激素結(jié)合球蛋白

Effect of Acupoint Catgut Embedding on Chronic Inflammation in Rats with Insulin

Resistance Model of Polycystic Ovary Syndrome

LI Huizhen，TONG Li，CHEN Xiuping，LI Yongping，SUN Wenping

（1 Qinghai Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research for Glucolipid Metabolic Diseases，

Xining 810001，China; 2 Qinghai Red Cross Hospital，Xining 810000，China）

AbstractObjective：To investigate the therapeutic effect of catgut embedding at acupoint on insulin resistance（PCOSIR） in rats with ovarian syndrome.Methods：All 48 female SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，a metformin group and an acupoint catgut embedding group，eight in each group.Except for the normal group，PCOSIR model was established by subcutaneous injection of dehydroepiandrosterone into the rest of the groups.Interventions were according to each treatment plan，lasting for 28 days.Histomorphology changes of ovary were observed by HE staining; ELISA methods were used to quantify serum FINS，CRP，LH，SHBG and keto testosterone（T）.The HOMAIR and FAI values were calculated with relevant formulas.Results：Comparing with the normal group，ovarian corpus luteum，normal follicles were rare in the model group，with the number of atresia follicles increased and a large number of granulosa cell nuclei shrank and disintegrated in atresia follicles，granulosa cells being squeezed to the margin，arranged disorderedly; and a large number of cystic dilated follicles were found in the model group; serum FINS，F(xiàn)BG，HOMAIR，CRP，LH，T and FAI levels in rats increased significantly（P<0.01） and SHBG levels decreased（P<0.05）.When compared with the model group，the corpus luteum increased，vesicles and atresia follicles decreased; granulosa cells were arranged regularly，especially that the number and development of follicles at all levels in the combined group were close to normal level; and no cystic changes were found; the serum FINS，F(xiàn)BG，HOMAIR，CRP，T，F(xiàn)AI，LH level of rats decreased significantly（P<0.01） and SHBG level increased（P<0.05）.Conclusion：Acupoint catgut embedding therapy can improve the level of sex hormones，IR and chronic inflammation in PCOSIR model rats.This therapy is convenient，simple，safe and it has less side effects.It is worthy of being widely popularized in the clinical application.

KeywordsAcupoint catgut embedding; Polycystic ovarian syndrome; Insulin resistance; Chronic inflammation; CRP; FAI; SHBG

中圖分類號：R271.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.006

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是一種常見的異質(zhì)性疾病，且多以內(nèi)分泌紊亂為特征[1]。目前國內(nèi)育齡期女性PCOS發(fā)病率為6%～10%，其中不孕者達(dá)30%～60%，嚴(yán)重威脅女性健康并影響家庭幸福[23]。大量研究認(rèn)為胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是PCOS發(fā)病的核心，流行病學(xué)顯示50%～70%的PCOS患者存在IR。另外有研究發(fā)現(xiàn)PCOS及PCOSIR患者外周血中炎癥介質(zhì)水平升高，說明該病患者長期處于一種慢性低度炎癥狀態(tài)。目前該病西醫(yī)治療方法主要有藥物干預(yù)和手術(shù)治療，但常有服藥后不良反應(yīng)大和術(shù)后附件易粘連等弊端。因此中醫(yī)治療PCOS已成為趨勢，其中穴位埋線由針灸理論發(fā)展而來，通過對穴位的不間斷多重長久良性刺激，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)在平衡，對許多慢性疾病的療效是肯定的?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，穴位埋線能夠能調(diào)節(jié)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOSIR）大鼠生殖內(nèi)分泌紊亂，降低雄激素水平，改善大鼠IR情況[45]。還可加速炎癥吸收[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)中醫(yī)生殖軸選穴針刺或聯(lián)合五子衍宗丸可很好地改善PCOSIR大鼠生殖內(nèi)分泌水平及IR情況[78]。但目前穴位埋線治療PCOSIR伴慢性炎癥的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)沿用本團(tuán)隊(duì)前期選穴方法對癥選穴埋線，觀察其對PCOSIR模型大鼠伴慢性炎癥的療效。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康4周齡SD清潔雌性大鼠32只，體質(zhì)量（60±5）g。購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號：SCXK（陜）2018001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物福利倫理委員會批準(zhǔn)通過（倫理審批號：201801），實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵照我國科學(xué)技部門頒發(fā)的法律文件規(guī)范進(jìn)行。

1.1.2藥物注射用油（上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：16030510）;脫氫表雄酮（上海源葉生物科技有限公司，批號：16082009）、鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，生產(chǎn)批號：ACA4682）

1.1.3試劑與儀器FINSElisas試劑盒（批號：EELR2466c）、CRPElisas試劑盒（批號：EELR0022c）、LHElisas試劑盒（批號：EELR0026c）、SHBGElisas試劑盒（批號：EELR0883c）、TElisas試劑盒批號：EELR0155c），以上均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。血糖儀（江蘇魚躍設(shè)備醫(yī)療股份有限公司，型號：580）、低溫離心機(jī)（湖南湘儀有限公司，型號：H2050R）、恒溫箱（上海瑯玹實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：FCD2000）酶標(biāo)儀（深圳雷杜醫(yī)療有限公司，型號：RT6500）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后將32只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、二甲雙胍組、穴位埋線組。除正常組外，其余各組SD大鼠頸背部皮下注射溶于注射用大豆油的脫氫表雄酮（DHEA）溶液0.2 mL（6 mg/100 g），10 d后通過巴氏染色觀察其陰道上皮細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)涂片10 d，若此期出現(xiàn)連續(xù)角化狀態(tài)的陰道上皮細(xì)胞，則表明健康大鼠成功誘導(dǎo)為PCOS模型，于當(dāng)晚9：00對PCOS模型大鼠禁食，12 h后眶靜脈取血。即刻測空腹血糖及空腹胰島素水平，計(jì)算HOMAIR，以HOMAIR>2.8為胰島素抵抗標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2干預(yù)方式正常組按20 mL/kg行飲用水灌胃，1次/d，連續(xù)28 d;模型組干預(yù)方式同正常組;穴位埋線組選擇脾俞、胰俞、腎俞、關(guān)元、中脘、子宮、三陰交行埋線（定位參照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜”），線長0.5 cm，1次/周，共4次;二甲雙胍組給予2 mL二甲雙胍溶液灌胃，100 mg/kg，1次/d，連續(xù)28 d;治療期間各組繼續(xù)注射脫氫表雄酮，以防止其自身恢復(fù)排卵。

1.2.3檢測指標(biāo)與方法經(jīng)腹腔用水合氯醛進(jìn)行麻醉，行腹主動(dòng)脈采血，抗凝管置于離心機(jī)，離心15 min（3 000 r/min，離心半徑6 cm），分離血清，放置在-20 ℃冰箱保存，備用。采血結(jié)束，大鼠即刻斷頸處死，剝?nèi)蓚?cè)卵巢，生理鹽水清洗后，一側(cè)卵巢以多聚甲醛中固定，另一側(cè)卵巢液氮冷凍，存置-86 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3.1卵巢形態(tài)觀察將固定在多聚甲醛中的卵巢組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，蘇木精染色5 min，分化液分化，伊紅染色5 min，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢采集圖像。治療周期結(jié)束后當(dāng)晚9：00禁食，12 h后眶靜脈取血檢測空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS）。

1.2.3.2測定大鼠血清生化指標(biāo)測定FINS、C反應(yīng)蛋白（CRP）、黃體生成素（LH）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）和睪酮（T）含量，并計(jì)算HOMAIR及游離睪酮（Free Testosterone Index，F(xiàn)AI）指數(shù)，F(xiàn)AI=T/SHBG×100。各項(xiàng)指標(biāo)含量測定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明書。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，多重兩兩比較方差齊時(shí)采用LSDt檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1造模期間大鼠陰道脫落細(xì)胞形態(tài)變化造模組大鼠陰道脫落細(xì)胞在2個(gè)動(dòng)情周期（10 d）中呈現(xiàn)連續(xù)角化狀態(tài)，表明PCOS造模成功。見圖1。

2.2各組大鼠卵巢形態(tài)變化正常組：大鼠卵巢組織被膜完整，可見大量黃體，不同階段卵泡發(fā)育及數(shù)量正常，少量閉鎖卵泡，未見囊樣擴(kuò)張的卵泡，結(jié)締組織排列緊密;模型組：大鼠卵巢組織被膜完整，黃體數(shù)量較少，各級卵泡數(shù)量減少，正常卵泡少見，閉鎖卵泡數(shù)增多，閉鎖卵泡內(nèi)見大量的顆粒細(xì)胞核固縮、崩解，顆粒層細(xì)胞被擠壓至邊緣，排列無序，見大量囊樣擴(kuò)張卵泡;穴位埋線組：大鼠卵巢組織被膜完整，可見大量黃體，各級卵泡數(shù)量略減少，個(gè)別次級卵泡呈囊樣擴(kuò)張，顆粒層細(xì)胞少量細(xì)胞脫落壞死;二甲雙胍組：大鼠卵巢組織被膜完整，可見大量黃體，各級卵泡數(shù)量略減少，個(gè)別次級卵泡呈囊樣擴(kuò)張，顆粒層細(xì)胞排列整齊。見圖2。

2.3各組大鼠FBG、FINS、HOMAIR及CRP水平變化與正常組比較，模型組大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR及CRP水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組和穴位埋線組大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR及CRP水平均顯著降低（P<0.01）;此2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

2.4各組大鼠LH、SHBG、T、FAI水平變化與正常組比較，模型組大鼠血清LH、T、FAI水平均顯著升高（P<0.01），SHBG水平降低（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組、穴位埋線組小鼠血清T、FAI、LH水平均顯著降低（P<0.01），穴位埋線組SHBG水平升高（P<0.05）;二甲雙胍組、穴位埋線組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

3討論

近幾年不斷有研究發(fā)現(xiàn)，PCOSIR患者長期處于慢性低度的亞臨床炎癥狀態(tài)[9]。PCOS及PCOSIR患者無論是否肥胖，炎癥介質(zhì)水平都有不同程度的升高，但是肥胖會加重慢性低度炎癥狀態(tài)[1011]。HA、IR及慢性炎癥之間的相互作用關(guān)系至今未曾出現(xiàn)統(tǒng)一定論。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PCOS慢性非特異性炎癥性可以通過影響下丘腦垂體性腺軸功能而引起卵巢功能的受損，也可以通過刺激卵巢而誘發(fā)高雄激素血癥，同時(shí)加重IR[12]。慢性低度炎癥也有可能介導(dǎo)交感神經(jīng)功能障礙對HA和IR的影響，即IR、HA、交感神經(jīng)功能障礙和慢性低度炎癥可能在PCOS的病理生理過程中以惡性循環(huán)共同作用[13]。Souza Dos Santos等[14]測定PCOS患者炎癥狀態(tài)及胰島素抵抗水平后證實(shí)PCOS患者CRP及HOMAIR水平升高。CRP是體內(nèi)最重要的炎癥標(biāo)志物，其可促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)合成分泌并且會擴(kuò)大機(jī)體整體的炎癥程度。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎虛精虧、沖任不足是PCOS發(fā)病的主要原因，二者會影響腎天癸沖任胞宮軸功能。腎為氣之根本，腎氣不足，則使機(jī)體正氣虧虛，抵御外邪及祛邪外出作用減弱，是PCOS女性體內(nèi)微炎癥存在的內(nèi)在基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代臨床研究，張曉甦老師提出該病之所以纏綿難愈、易于反復(fù)，與其長期存在的微炎癥狀態(tài)密切相關(guān)[15]。

穴位埋線的原理當(dāng)然離不開針灸理論，較普通針刺，穴位埋線則是通過不間斷長久良性刺激，起到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)陰陽的作用，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)在平衡，對許多慢性疾病的療效是肯定的。有研究發(fā)現(xiàn)穴位埋線在慢性炎癥方面的作用機(jī)制可能是使神經(jīng)體液系統(tǒng)發(fā)揮一系列的調(diào)節(jié)作用，提高機(jī)體的營養(yǎng)代謝、促進(jìn)血液循環(huán)，進(jìn)而加速炎癥吸收[6]。另外有研究表明穴位埋線可以使PCOS患者的體質(zhì)量指數(shù)（BMI）和IR下降[16]。脾俞、胰俞和腎俞穴，三穴為背腧穴，共奏養(yǎng)胰健脾、補(bǔ)益脾腎、益精填髓之效。電針脾俞和胰俞穴均可有效降低2型糖尿病大鼠的FBG，另外電針胰俞穴可降低2型糖尿病大鼠胰島素抵抗、提高其胰島素敏感指數(shù)[17]。腎俞穴為腎之背腧穴，為滋補(bǔ)腎陰的第一要穴。針刺腎俞穴可以通過增加垂體及血清LH、卵泡刺激素（FSH）的含量，即通過調(diào)節(jié)性激素，使內(nèi)分泌水平得到恢復(fù)[18]。三陰交可同時(shí)調(diào)理肝、脾、腎三經(jīng)，也是治療婦科疾病常用的經(jīng)驗(yàn)穴，關(guān)元穴培元固本、補(bǔ)益下焦;有研究發(fā)現(xiàn)對三陰交、關(guān)元等穴位電針可改善PCOS大鼠高雄激素血癥、調(diào)節(jié)雄激素受體的表達(dá)，還可改善卵泡發(fā)育[1920]。由此推斷對以上穴位進(jìn)行穴位埋線，也可調(diào)節(jié)性激素水平，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相符：子宮穴補(bǔ)益沖任、調(diào)攝經(jīng)血，中脘穴健運(yùn)脾氣、升清降濁。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對上述穴位進(jìn)行穴位埋線治療后大鼠卵巢組織可見大量黃體，較模型組囊樣擴(kuò)張的卵泡數(shù)量明顯減少，大鼠體內(nèi)FAI、T、LH等性激素相關(guān)水平、胰島素抵抗指數(shù)及CRP水平下調(diào)（P<0.01），SHBG水平上調(diào)（P<0.05），考慮可能是以上穴位組合后對主要對雄激素起到下調(diào)作用，進(jìn)而改善其胰島素抵抗與慢性炎癥改變;也可能是埋線使神經(jīng)體液系統(tǒng)發(fā)揮一系列的調(diào)節(jié)作用，使血液循環(huán)加速，改善胰島素抵抗，促使炎癥吸收。

綜上所述，選腎俞、胰俞、脾俞、三陰交、關(guān)元、子宮、中脘等穴進(jìn)行穴位埋線聯(lián)合覆盆子治療PCOSIR伴慢性炎癥效果顯著。二者聯(lián)合后可能同時(shí)改善了胰島素抵抗、高雄激素水平及慢性炎癥狀態(tài)，但HA、IR及慢性炎癥之間的相互作用關(guān)系仍無法明確，可能其中有某種信號通路的參與，因此對于以上三者的關(guān)系及可能的相關(guān)信號通路還有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：中醫(yī)藥高層次人才培訓(xùn)基地建設(shè)項(xiàng)目（國中醫(yī)藥人教函[2019]128號）;青海省衛(wèi)健委中藏醫(yī)藥研究課題（2019wjzdx69）——針?biāo)幐深A(yù)對PCOSIR模型大鼠慢性炎癥的分子機(jī)制研究

作者簡介：李慧禎（1996.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：針刺效應(yīng)機(jī)制研究，Email：1573788685@qq.com

通信作者：李永平（1978.08—），男，碩士，副教授，研究方向：針灸效應(yīng)機(jī)制研究，Email：liyongping1122@163.com