7種殺菌劑和5種植物抗病激活劑對(duì)油茶炭疽病病菌活性研究

王翠蘭，左璐瑩，張紹勇，陳安良*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

油茶(Camelliaoleifera)山茶科屬，是世界四大木本油料植物之一，中國(guó)特有的油料植物[1-2]。茶油既可用于食用，也可用于工業(yè)，茶籽餅不僅可用于生產(chǎn)洗凈劑及動(dòng)物飼料，也是有機(jī)肥的重要原料，其產(chǎn)品鏈的延伸，可有效帶動(dòng)山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3-4]。

膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是目前引起油茶炭疽病的主要病原菌，主要危害油茶葉片及果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)可造成大面積落葉、落果、落蕾，甚至整株枯死[5]。病果產(chǎn)油量?jī)H為健康果的50%，炭疽病重災(zāi)區(qū)油茶減產(chǎn)高達(dá)40%～50%，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[6]。

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)膠孢炭疽病菌的防治研究多數(shù)局限于殺菌劑篩選，通過(guò)輪換殺菌劑，減緩其抗藥性的發(fā)生。殺菌劑通過(guò)直接抑制病原菌的生長(zhǎng)，具有毒殺性，頻繁使用即污染環(huán)境，食品安全也受威脅。同時(shí)，病害防治是以防重于治的原則，因此很有必要研究開(kāi)發(fā)新型藥劑。植物抗病激活劑是新型農(nóng)藥重要的發(fā)展方向，與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，可激活植物免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)植物新陳代謝，進(jìn)而提高植物抗病和抗逆能力[7]，誘導(dǎo)植物對(duì)多種病害產(chǎn)生抗性，且對(duì)環(huán)境安全友好。自Asai等[8]研究發(fā)現(xiàn)植物自身存在保護(hù)機(jī)制，可抵御細(xì)菌及霉菌的侵染，至今已有不少相關(guān)研究報(bào)道，如W.S.Park等[9]確定了水楊酸甲酯是植物免疫響應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)；李天來(lái)等[10]研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯+Ca處理番茄幼苗可顯著降低灰霉病的發(fā)病率；張穗[11]研究發(fā)現(xiàn)，使用井崗霉素處理水稻后，植株對(duì)水稻紋枯病菌的控制效果明顯，程小龍[12]則發(fā)現(xiàn)在煙草植株上，0.5 mg/L水楊酸對(duì)煙草青枯病誘抗效果最好。關(guān)于油茶炭疽病的防治雖有不少報(bào)道，但以殺菌劑和植物抗病激活劑為主，進(jìn)行系統(tǒng)篩選的研究較少。本研究旨在篩選出可誘導(dǎo)油茶產(chǎn)生高效抗病性的植物抗病激活劑，和高活性殺菌劑配合使用，以期研發(fā)出對(duì)油茶炭疽病高效、長(zhǎng)效的混配劑及其防治方法，從而減少殺菌劑的用量，提高油茶產(chǎn)品的安全性。為油茶林間綠色防治提供新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油茶由建德市欣林林木服務(wù)中心提供，為2年生盆栽苗。供試菌株膠孢炭疽菌由浙江農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科綠色農(nóng)藥2011協(xié)同創(chuàng)新中心菌種儲(chǔ)存室提供。殺菌劑：98%咪鮮胺(prochloraz)粉劑、98%多菌靈(carbendazim)粉劑、99%戊唑醇(tebuconazole)粉劑、95%甲基托布津(thiophanate-methyl)粉劑、60%啶氧菌酯(tebuconazole)粉劑、99%嘧菌酯(azoxystrobin)粉劑、98%百菌清(prochloraz)粉劑，均購(gòu)于上海源葉生物有限公司；植物抗病激活劑：99.5%水楊酸(salicylic acid，SA)粉劑、95%井崗霉素(validamycin)粉劑、95%茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)水劑、95%蕓苔素內(nèi)酯(brassinolide)粉劑、98% 2,1,3-苯并噻二唑(2,1,3-Benzothiadiazole)粉劑，均購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司。

1.2 殺菌劑對(duì)油茶炭疽病病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

1.2.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用菌絲生長(zhǎng)速率法。以預(yù)試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，將咪鮮胺、多菌靈配置為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L；甲基托布津、戊唑醇、啶氧菌酯、嘧菌酯、百菌清分別配置為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L。再在超凈工作臺(tái)中，將藥劑與融化的PDA培養(yǎng)基按1∶9比例混合，制備含毒培養(yǎng)基。將供試菌株接種于經(jīng)高溫滅菌的PDA平板上，于25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d，用滅菌打孔器取直徑5 mm菌餅，接種于各處理下含毒培養(yǎng)基上，每處理3重復(fù)，以同體積不含藥培養(yǎng)基為對(duì)照，25 ℃恒溫培養(yǎng)。5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

抑菌率/%=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100

(1)

1.3 植物抗病激活劑活性測(cè)定方法

1.3.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 與1.2.1方法相同。

1.3.2 活體測(cè)定法 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，水楊酸、井岡霉素配制質(zhì)量濃度為200、100、50 mg/L；茉莉酸甲酯、蕓苔素內(nèi)酯及2,1,3-苯并噻二唑配制質(zhì)量濃度為100、50、25 mg/L。分別將不同濃度的誘抗劑噴灑于長(zhǎng)勢(shì)良好且大小一致的2年生油茶苗上，噴至葉片完全潤(rùn)濕即可，2 d后再重復(fù)噴灑1次，再過(guò)5 d后從油茶植株上采摘葉片，以剛成熟的黃綠色嫩葉為宜，使用對(duì)葉片接種針進(jìn)行刺傷，不宜刺穿葉片，最后將孢子懸浮液(103～106個(gè)/mL)用滅菌毛筆涂抹接種，然后置于帶有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，黑暗條件25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，每個(gè)處理3株，每株采集4片葉，以無(wú)菌水做空白對(duì)照。7 d后采用網(wǎng)格法，測(cè)量各葉片的病斑擴(kuò)展面積，以病斑減小率表示各藥劑的誘抗效果。

病斑減小率/%=對(duì)照處理病斑面積-誘導(dǎo)處理病斑面積/對(duì)照處理病斑面積×100

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算各藥劑的不同濃度處理后菌絲抑制率，通過(guò)SPSS version22 Probit分析，得到其線性回歸方程及EC50。植物抗病激活劑活體篩選試驗(yàn)的結(jié)果，分別進(jìn)行方差分析及顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

在各供試濃度條件下，7種殺菌劑對(duì)油茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用。由表1可知，咪鮮胺對(duì)其病原菌的生物活性最強(qiáng)，EC50為0.129 mg/L；其次為多菌靈，EC50為0.229 mg/L；而甲基托布津、戊唑醇、啶氧菌酯、嘧菌酯、百菌清對(duì)其生物活性相對(duì)較低，EC50分別為0.771、3.11、21.937、28.666、52.110 mg/L。因此，7種殺菌劑中，咪鮮胺對(duì)油茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性更佳。

表1 7種供試殺菌劑對(duì)膠孢炭疽菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 植物抗病激活劑對(duì)油茶炭疽菌的活性測(cè)定

2.2.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了5種植物抗病激活劑的活性。含誘抗劑的PDA平板與對(duì)照相比，病原菌的菌落形狀，生長(zhǎng)速度及顏色等外觀特征均無(wú)明顯差異。各處理下菌絲生長(zhǎng)直徑與對(duì)照相比差異性均未達(dá)到顯著水平。高濃度處理的各個(gè)誘抗劑對(duì)其菌絲生長(zhǎng)略有些抑制作用。

2.2.2 5種植物抗病激活劑對(duì)油茶的誘抗效果 通過(guò)對(duì)油茶進(jìn)行活體噴藥后，5種植物抗病激活劑在不同濃度處理下對(duì)油茶炭疽病均具有一定的誘抗效果。其中水楊酸，蕓苔素內(nèi)酯及茉莉酸甲酯在各處理下均具有較好的誘抗效果，最高誘抗效果依次為50.13%、36.82%、26.93%；其他2種誘抗劑井崗霉素和苯并噻二唑最高誘抗效果僅為19.67%和17.73%，兩者誘抗效果相當(dāng)，均較差。5種植物抗病激活劑在各濃度處理下，以水楊酸處理的誘抗效果最佳，最適誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為100 mg/L。

表2 5種植物抗病激活劑對(duì)油茶葉片病斑擴(kuò)展的影響

3 結(jié)論與討論

本研究分別測(cè)定了7種殺菌劑和5種植物抗病激活劑對(duì)膠孢炭疽菌的活性，供試殺菌劑中咪鮮胺、多菌靈、甲基托布津、戊唑醇均有較好的抑制作用，其中咪鮮胺抑菌效果最佳，啶氧菌酯、百菌清、嘧菌酯抑菌效果均較差。油茶通過(guò)5種植物抗病激活劑處理后，對(duì)膠孢炭疽病菌的誘抗效果均不同，初步確定最適誘抗劑為水楊酸，最佳防治質(zhì)量濃度為100 mg/L，誘抗效果達(dá)50.13%，本研究中殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果與前人研究成果類(lèi)似[13]。咪鮮胺DMIs類(lèi)殺菌劑可抑制真菌中麥角甾醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶 CYP51 的合成，阻礙麥角甾醇的合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡，兼具內(nèi)吸和保護(hù)作用[14-15]。啶氧菌酯與嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑可抑制真菌線粒體呼吸，主要表現(xiàn)對(duì)孢子生長(zhǎng)的抑制作用[15]。因此在此試驗(yàn)中活性較其他幾種的抑菌活性差。油茶誘導(dǎo)抗性結(jié)果與王宏虬等人研究馬鈴薯對(duì)瘡痂病誘抗篩選一致[16]，以及與王軍等[17]、李姝江等[18]采用SA誘導(dǎo)茶樹(shù)產(chǎn)生抗性研究結(jié)果相似。

植物抗病激活劑可顯著提高植物的免疫防御能力，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜的抗病性，從而使植物抵御病原菌的侵害[19]。目前，關(guān)于水楊酸誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的研究，多數(shù)集中在農(nóng)作物上，如SA誘導(dǎo)水稻幼苗抗白葉枯病(Xanthomonasoryzae)的最適誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為5～50 μg/mL[20]；M.Kubota等[21]研究發(fā)現(xiàn)SA可誘導(dǎo)黃瓜對(duì)炭疽病產(chǎn)生抗性；張瑩等[22]發(fā)現(xiàn)SA可誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生對(duì)玉米大斑病(Exserohilumturcicum)的抗性作用；而木本植物的研究報(bào)道鮮少。本次試驗(yàn)在已廣泛研究的殺菌劑基礎(chǔ)上，增加植物抗病激活劑對(duì)油茶誘導(dǎo)抗性的活性測(cè)定，研究結(jié)果以期為研發(fā)殺菌劑和植物抗病激活劑混劑，用于防治油茶炭疽病提供一定的參考價(jià)值，同時(shí)，為油茶炭疽病防治中的“減藥增效”提供新方法。