外源NO對(duì)核桃幼苗葉多酚及其抗氧化活性的影響

任 斌，王田雨，黃倩雪，謝牧洪，張尚昆，郝 艷，楊桂燕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西省核桃工程技術(shù)研究中心，陜西 楊陵 712100)

核桃(Juglansregia)是世界上分布廣泛，具有重要價(jià)值的木本植物。在我國(guó)決戰(zhàn)決勝脫貧攻堅(jiān)上，核桃是規(guī)模較大、覆蓋最廣、惠及農(nóng)戶最多的第1大經(jīng)濟(jì)林果，在農(nóng)戶持續(xù)增收等方面發(fā)揮了重要作用。核桃果實(shí)中含有多種有益物質(zhì)，如不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、生育酚和黃酮，有健腦益智、預(yù)防心血管疾病、降血脂、降糖等多種作用，因此引起廣泛關(guān)注和研究。但近年來(lái)，霜凍害嚴(yán)重制約核桃產(chǎn)量，給廣大果農(nóng)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重?fù)p害了核桃產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[1]。如陜西地區(qū)頻繁出現(xiàn)的‘倒春寒’現(xiàn)象，在2018年導(dǎo)致商洛等地區(qū)的大面積核桃絕收；持續(xù)高溫干旱氣候，使得核桃果實(shí)落果現(xiàn)象增強(qiáng)。這對(duì)提高核桃的抗逆提出了新的要求。

植物多酚包括簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)物質(zhì)(如酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物)和高分子聚合物(如木質(zhì)素、單寧)[2]，以類(lèi)黃酮化合物最為常見(jiàn)。植物多酚積累與逆境響應(yīng)具有重要關(guān)系，如，低溫脅迫下，油菜素類(lèi)固醇增強(qiáng)型表達(dá)基因BEE1與G2-類(lèi)黃酮調(diào)節(jié)因子GFR通過(guò)抑制TT8、GL3(Glabrous3)和(/或)MYB的表達(dá)負(fù)調(diào)控花青素積累[3]。核桃種仁、青皮、葉片、樹(shù)皮、花及枝條等各部分組織均含有高含量的多酚類(lèi)物質(zhì)[4]。劉暢等[2]研究表明，核桃中的多酚含量為油菜籽的1.65倍，其抗氧化能力與Vc相當(dāng)或僅次于Vc。其他許多試驗(yàn)也證實(shí)核桃多酚具有優(yōu)異的抗氧化及自由基清除能力[5-6]?；诖耍颂叶喾酉嚓P(guān)產(chǎn)品逐漸被應(yīng)用于醫(yī)藥(抗氧化調(diào)節(jié)劑等)、工業(yè)(化妝品和洗滌劑等)、農(nóng)業(yè)(飼料等)等各個(gè)領(lǐng)域。同時(shí)，宋宇琴等[7]研究表明，核桃枝條總酚含量與抗寒、抗病相關(guān)，核桃1年生枝條韌皮部的總酚含量可作為判斷核桃樹(shù)體抗寒性的生理指標(biāo)?？梢?jiàn)，探究核桃多酚類(lèi)物質(zhì)的積累與核桃逆境耐受性之間的關(guān)系具有重要應(yīng)用意義。

NO是重要的活性氮(RNS)，低濃度NO可作為抗氧化劑迅速清除活性氧(ROS)，并且能誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高酶活性，與植物抗逆具有重要關(guān)系[8]。同時(shí)NO被認(rèn)為是高等植物中重要的內(nèi)源成熟和衰老調(diào)節(jié)劑，在調(diào)控植物發(fā)育、代謝、抗病性、脅迫和防御反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用[9]。如，在施加硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)提供外源NO情況下，翅果油樹(shù)(Elaeagnusmollis)幼苗葉片葉綠素含量和葉片凈光合速率提高而增強(qiáng)了對(duì)干旱的抵抗力[10]，苦瓜(Momordicacharantia)的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性及超氧化物酶(SOD)活性均被增強(qiáng)進(jìn)而提高了低溫適應(yīng)性，促進(jìn)低溫脅迫下苦瓜幼苗的生長(zhǎng)[11]。在抵抗鹽脅迫方面，外源NO可以提高煙草(Nicotianatabacum)幼苗水分含量、葉綠素含量、根系活力以及多種抗氧化酶活性，從而減小鹽脅迫對(duì)幼苗的傷害[12]。目前，關(guān)于外源NO對(duì)植物幼苗影響的研究多在草本植物以及其他農(nóng)作物，針對(duì)核桃幼苗的研究還相對(duì)缺乏。因此，本研究通過(guò)不同濃度SNP對(duì)核桃多酚積累及抗氧化酶活性的影響，得出最適SNP濃度，可直接反應(yīng)其與核桃抗逆之間的關(guān)系，有利于揭示外源NO影響核桃抗逆的可能作用機(jī)制，為外源NO(SNP)在核桃抗逆生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

‘香玲’核桃種子經(jīng)2周浸泡預(yù)處理后種植于營(yíng)養(yǎng)土——V(珍珠巖)∶V(蛭石)∶V(基質(zhì))=1∶2∶3，培養(yǎng)1 a。然后將‘香玲’核桃接穗嫁接于實(shí)生苗上，培養(yǎng)至1年生，用于SNP處理。查閱文獻(xiàn)總結(jié)草本或木本植物進(jìn)行SNP處理的最適濃度，其范圍跨度較大，為0.1～0.5 mmol/L(表1)。因此，本研究針對(duì)核桃葉進(jìn)行0、10、50、100、150、200、300、500 μmol/L的SNP處理，將配置好的不同濃度的SNP溶液于18:00噴灑于核桃植株的葉表面，每隔3 d噴施處理液1次，處理15 d后取葉進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，篩選最適濃度。

表1 不同植物SNP最適濃度

1.2 核桃葉多酚、總黃酮含量的測(cè)定

分別用200 μL量程移液器吸取0、60、120、180、240、300 μL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液于試管中，再分別加入1 mL Folin-酚試劑，搖勻靜置5 min，再加入碳酸鈉(7.5%)溶液3 mL，并加水定容至10 mL，40 ℃水浴并暗中處理60 min。設(shè)定波長(zhǎng)為760 nm，測(cè)量各組樣品的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.067x-0.005 3，R2=0.996。依據(jù)Folin-酚法提取葉總多酚[19]，總酚含量=0.003 75G/W×100%，G為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查的總酚含量，單位μg；W為樣品重量，單位g。

分別用200 μL量程移液器吸取1、2、3、4、5、6 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.2 mg/mL)于25 mL容量瓶，再分別加1 mL 5%的NaNO2、10%的Al(NO3)3。混勻室溫靜置6 min，再加入10 mL 4%的NaOH，定容至25 mL，混勻，室溫靜置15 min。70%乙醇為空白對(duì)照。測(cè)定510 nm處的吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.113 7x+0.001 4，R2=0.991 2。依此采用比色法測(cè)定各樣品的總黃酮含量[20]。

采用Al(NO3)3比色法測(cè)定各樣品(試驗(yàn)組與對(duì)照組)溶液的總黃酮含量。取上述核桃葉應(yīng)用液0.5 mL加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后并放置6 min，再加入1 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后，室溫下靜置6 min，加入4% NaOH溶液10 mL，加水定容至25 mL，搖勻放置15 min。在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度，以乙醇為空白對(duì)照。樣品中總黃酮的含量以1 g核桃葉中總黃酮的當(dāng)量蘆丁來(lái)表示(mg/g)。

1.3 核桃葉多酚抗氧化活性測(cè)定

1.3.1 DPPH·清除能力 采用2,4-二硝基苯肼比色法測(cè)定Vc含量[21]，以空白液作為對(duì)照，在517 nm處測(cè)定所有樣品的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.848 7x+0.880 3，R2=0.992 4。采用80%的乙醇溶液分別配制核桃葉的提取物及各萃取部分一系列不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75 mg/mL)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式(1)計(jì)算DPPH·清除率。

DPPH·清除率=[A空白-(A樣品-A對(duì)照)]/A空白×100%

(1)

式中：A空白、A樣品、A對(duì)照分別為空白管、樣品管、對(duì)照管吸光值。下同。

1.3.2 ABTS·清除能力測(cè)定 采取2,4-二硝基苯肼比色法，在734 nm處測(cè)定所有樣品的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-58 688x+0.633 5，R2=0.991 2。用80%乙醇溶液分別配制提取物及各部分一系列不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(0、12.5、25、37.5、50、75、100 μg/mL)，按照式(2)計(jì)算ABTS·清除率[22]。

ABTS·清除率=[A空白-(A樣品-A對(duì)照)]/A空白×100%

(2)

1.4 核桃葉抗氧化酶活性測(cè)定

SOD活性用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，POD活性用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定[23]。GST活性用谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)試劑盒(比色法)(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。

1.5 葉多酚含量與其他指標(biāo)之間的差異顯著性分析

采用多重比較法和q值檢驗(yàn)法分析上述得到的數(shù)據(jù)，將核桃葉總多酚的含量與核桃葉總黃酮含量以及相關(guān)自由基的清除能力對(duì)比分析；將總多酚含量與相關(guān)抗氧化酶活性進(jìn)行分析，得到總多酚含量與其他指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP處理下核桃葉總多酚、總黃酮含量變化

對(duì)不同濃度SNP處理后的葉多酚積累進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0～50 μmol/L SNP處理下，植株的總多酚含量沒(méi)有明顯變化；濃度為100～150 μmol/L時(shí)，核桃葉總多酚含量隨著濃度增加逐漸增多，之后開(kāi)始逐漸下降；濃度為200～500 μmol/L時(shí)，總多酚含量下降幅度較大，在SNP濃度為150 μmol/L，葉總多酚含量最大，為26.45 mg/g(圖1A)?？傸S酮含量隨著SNP濃度的變化與葉總多酚一致，在0～50 μmol/L時(shí)，總黃酮含量變化不大，SNP濃度為150 μmol/L時(shí)，達(dá)到最大值，葉總黃酮含量為15.04 mg/g；之后開(kāi)始逐漸下降(圖1B)。可見(jiàn)，對(duì)1年生‘香玲’核桃，最適調(diào)節(jié)濃度SNP可能為150 μmol/L。

2.2 SNP對(duì)核桃葉多酚抗氧化活性的影響

DPPH·和ABTS·清除率是多酚抗氧化活性的重要表現(xiàn)。對(duì)不同濃度SNP處理后的植株進(jìn)行DPPH·清除率測(cè)定，DPPH·清除率越大，核桃葉多酚的抗氧化能力就越強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)DPPH·清除率的變化與多酚含量及黃酮含量變化趨勢(shì)一致，都在150 μmol/L處理下，達(dá)到最大值，為35.86 mg Vc/g(圖2A)。ABTS·清除率的變化與DPPH·變化趨勢(shì)一致，在150 μmol/L處理下，達(dá)到最大值，為46.87 mg/g(圖2B)。表明核桃葉多酚抗氧化能力在150 μmol/L SNP處理下最強(qiáng)。

2.3 SNP對(duì)核桃葉抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性變化可以反映SNP處理調(diào)控哪些物質(zhì)和代謝通路來(lái)調(diào)控植株增強(qiáng)抗性。結(jié)果顯示，SNP處理下SOD活性隨著SNP濃度增大逐漸增加，當(dāng)SNP濃度為150 μmol/L后緩慢降低，但降低幅度較小(圖3A)。POD活性變化與SOD一致，在SNP濃度為150 μmol/L時(shí)，POD活性最高(圖3B)。GST活性在SNP處理下的變化與POD比較相似，SNP為0～10 μmol/L時(shí)，GST活性基本沒(méi)發(fā)生改變，50 μmol/L之后GST活性顯著增強(qiáng)，在濃度為150 μmol/L時(shí)GST活性最高，SNP濃度在200～500 μmol/L時(shí)，GST活性基本不發(fā)生改變(圖3C)。

2.4 SNP處理下核桃葉各指標(biāo)值之間的相關(guān)性

通過(guò)分析DPPH·清除率、ABTS·清除率等指標(biāo)之間的相關(guān)性，能夠明確各個(gè)指標(biāo)之間的關(guān)系。從表2可看出，總多酚與總黃酮、氧自由基清除、抗氧化酶活性等指標(biāo)之間具有顯著相關(guān)性。這表明，核桃葉多酚類(lèi)物質(zhì)能夠與黃酮類(lèi)物質(zhì)同步積累，共同增強(qiáng)抗氧化能力，同時(shí)與SOD、POD和GST等逆境響應(yīng)重要酶活性相關(guān)，推測(cè)SNP可多方面調(diào)節(jié)植株逆境過(guò)程涉及的抗性生理指標(biāo)，以此增強(qiáng)植株應(yīng)對(duì)不良刺激的潛力。

表2 各指標(biāo)相關(guān)性分析(P<0.01)

3 結(jié)論與討論

核桃是世界重要堅(jiān)果，在區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展上起到重要作用。我國(guó)核桃資源豐富，栽培歷史悠久，種植范圍廣泛且仍在擴(kuò)大，并培育出許多優(yōu)良品種。核桃種植區(qū)大多自然條件差，其產(chǎn)量和質(zhì)量受水資源直接制約，有著產(chǎn)量少、品質(zhì)劣等問(wèn)題。在北方，氣溫低，常出現(xiàn)凍害和霜害，使得核桃減產(chǎn)，很難維持核桃產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展[8]。而核桃葉中含有豐富的多酚活性物質(zhì)，在活性氧清除、抗氧化保護(hù)等方面具有重要作用；多酚含量與抗氧化活性也具有正相關(guān)性，其活性主要表現(xiàn)為抗氧化活性清除體內(nèi)自由基，同時(shí)多酚的抑菌能力與黃酮化合物有關(guān)[24-25]。由于低濃度的NO與植物抗性有重要關(guān)系，能夠誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高酶活性[8-17]，所以對(duì)外源NO對(duì)核桃多酚物質(zhì)積累及其抗氧化活性的影響研究十分必要。因此，本研究選用1年生‘香玲’核桃為試驗(yàn)材料，查閱相關(guān)文獻(xiàn)后初步篩選出最適SNP處理的濃度范圍，在該SNP濃度范圍處理下，核桃葉多酚及黃酮含量均在SNP濃度為150 μmol/L時(shí)達(dá)到最高，且該濃度下DPPH·和ABTS·清除能力達(dá)到最大值，分別為35.86、46.87 mg/g，抗氧化能力也最強(qiáng)；并且在該濃度下，SOD、POD、GST的活性也達(dá)到最高值。

有研究表明，在干旱脅迫下核桃幼苗葉面噴施SNP能通過(guò)提高干旱脅迫下葉片凈光合速率與氣孔導(dǎo)度、抗氧化酶活性等，減輕葉綠素含量的下降和活性氧、自由基的積累，由此加強(qiáng)對(duì)干旱脅迫下核桃幼苗的保護(hù)從而提高核桃抗旱性[26]。相昆等[8]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫破壞了細(xì)胞的活性氧清除功能，過(guò)多的活性氧無(wú)法被清除，導(dǎo)致O2-和H2O2含量升高，MDA的積累過(guò)快；當(dāng)外源NO處理核桃幼苗葉片后，活性氧下降，MDA儲(chǔ)存減少，膜結(jié)構(gòu)不被破壞，使細(xì)胞代謝正常，增強(qiáng)植株抗低溫脅迫力?？梢?jiàn)，基于核桃多酚類(lèi)物質(zhì)積累的特性，探究其逆境響應(yīng)機(jī)理，具有良好的研究前景。

綜上所述，對(duì)1年生‘香玲’核桃嫁接苗進(jìn)行處理時(shí)，SNP的最適濃度為150 μmol/L。這為今后外源NO在核桃抗逆生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供了理論依據(jù)。同時(shí)，外源NO對(duì)核桃多酚物質(zhì)積累及其抗氧化活性的影響，有利于揭示NO影響核桃抗逆的可能作用機(jī)制，進(jìn)而推進(jìn)尋找施加外源NO提高核桃抗逆的新方法。