海南島橡膠林土壤真菌群落多樣性的季節(jié)變化特征及其驅(qū)動因子分析

魏亞情，吳志祥，楊 川，蘭國玉*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，海南 ?？?571101；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測試驗站，海南 儋州 571737；3.海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南 ?？?570228)

海南島是中國緯度最低、面積最大的熱帶地區(qū)[1]。在過去的20 a里，橡膠種植園在整個東南亞地區(qū)迅速發(fā)展[2]。目前海南島的橡膠林分布約占總植被面積1/4[3]。因此，橡膠林已成為中國熱帶地區(qū)，尤其是海南最重要的植被生態(tài)系統(tǒng)[4]。土壤微生物在全球生態(tài)系統(tǒng)的中扮演著重要的角色，維持著多個生態(tài)系統(tǒng)過程的速率和穩(wěn)定性[5-6]。盡管橡膠種植面積迅速上升，但對土壤微生物群落的影響尚未得到檢驗[7]。因此，有必要更好地理解環(huán)境因素是如何調(diào)節(jié)地下群落的動態(tài)和結(jié)構(gòu)的。

海南島具有明顯的旱雨季變化，其獨特的氣候條件對土壤微生物群落的影響如何，目前對此方面的研究還尚有欠缺[23-25]。為解答以上問題，本試驗采集了海南5個地區(qū)旱季和雨季的130份橡膠林土壤樣本，使用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)手段對海南橡膠林旱季和雨季的土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行了分析，研究結(jié)果可為海南橡膠林生態(tài)系統(tǒng)的研究提供土壤微生物方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為進一步深入分析橡膠林微生物群落及其生態(tài)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣本采集

海南島面積為3.4萬km2，屬于海洋性熱帶季風(fēng)氣候，全年溫暖濕潤，年均溫度22～26 ℃；海南雨量充沛，年降水量1 000～2 600 mm，年平均降水量1 639 mm，有明顯的多雨季和少雨季。每年的5-10月是多雨季，總降水量達1 500 mm，占全年總降水量的70%～90%；每年11月至翌年4月為少雨季節(jié)，僅占全年降水量的10%～30%，橡膠林主要分布在中部山區(qū)四周的臺地及交通便利，靠近水源地的區(qū)域。共選擇了5個樣地，分別位于海南儋州、瓊中、萬寧、樂東和?？?，在每個樣地中隨機設(shè)置13個重復(fù)取樣點，旱季和雨季各采樣1次，每個點采樣2次，分別在2018年1月和7月進行取樣，共采集了130份土壤樣本。取樣步驟：取樣時除去地面植被和枯枝落葉，鏟除表面1 cm的表土，以避免地面微生物與土樣混雜。用直徑為4.5 cm的取土鉆進行采樣取土層0～20 cm，混合均勻后過2 mm篩子后，并按照要求將土樣分為3份，前2份帶回實驗室風(fēng)干處理或鮮樣分析，第3份用于高通量分析。用于高通量分析的土樣放入液氮罐中，帶回實驗室放入-80 ℃的冰箱中保存以待分析。土壤樣品采用標準的土壤試驗方法進行分析[26-28]。

1.2 DNA抽提和PCR擴增

土壤樣本由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。真菌采用ITS1F_ITS2R引物，引物序列為ITS1F(5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)[29]和ITS2R(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[30]，擴增程序為95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min，擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 m mol·L-1dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol·L-1)，0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物。

1.3 Illumina Miseq測序

利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxygenBiosciences，Union City，CA，USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進行定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(Illumina，SanDiego，USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE(2×250)的文庫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH軟件對原始數(shù)據(jù)序列進行篩選優(yōu)化，對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進行OTU聚類，得到相似性在97%以上的有效序列[30]。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU128)，設(shè)置比對閾值為70%，利用mothur計算不同隨機抽樣下的α多樣性指數(shù)[31]?；贐ray-Curtis距離，進行主坐標分析(PCoA)，揭示了2個季節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)相似性，用相似性分析(ANOSIM)分析季節(jié)對橡膠林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)差異。采用冗余分析(RDA)來揭示微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，計算在R的“Vegan”包中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌群落組成

對海南島橡膠林不同季節(jié)的土壤樣本進行高通量測序，共檢測到真菌9門、37綱、115目、289科、818屬，圖1展示了旱季和雨季土壤樣本在門和綱分類水平上的真菌群落組成。菌群門水平上，優(yōu)勢菌門依次為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota)，各優(yōu)勢菌門中，子囊菌門的相對豐度在雨季時顯著大于旱季(P<0.01，圖1)。在菌群綱水平上，優(yōu)勢菌綱依次是未分類真菌、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、未分類子囊菌門(unclassified_P_Ascomycota)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、norank_P_Zygomycota、norank_P_Ascomycota、古根菌綱(Archaeorhizomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)，其中未分類子囊菌門的相對豐度在雨季時顯著大于旱季(P<0.01)。

用PCoA(主坐標分析，基于Bray-Curtis距離)排序分析方法對群落組成進行可視化(圖2)，相似性分析(ANOSIM)結(jié)果表明，旱季和雨季土壤樣本間群落組成差異顯著(R=0.051，P=0.001)。通過置換多因素方差分析(PERMANOVA)分析不同分組對樣品差異的解釋度，結(jié)果表明，季節(jié)變化僅能解釋真菌群落組成差異的1.7%(R2=0.017，P=0.001)。

2.2 微生物群落多樣性

α多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，從ACE指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分析來看，雨季橡膠林土壤真菌ACE指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著高于旱季(P<0.05)，Simpson指數(shù)低于旱季(表1)。

表1 不同季節(jié)橡膠林土壤真菌多樣性指數(shù)

2.3 群落多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性

通過線性回歸分析可知，真菌α多樣性與pH，有機質(zhì)(SOM)，有效P(AP)，有效K(AK)，全N(TN)，溫度(Tem)呈顯著正相關(guān)(pH:R2=0.19，P<0.001；SOM:R2=0.06，P=0.005；AP:R2=0.08，P=0.001；AK:R2=0.06，P=0.004；TN:R2=0.13，P<0.001；Tem:R2=0.14，P<0.001)，所有的環(huán)境因子中，pH、全N和溫度是影響土壤真菌多樣性的主要環(huán)境因(圖3)。

RDA分析結(jié)果表明，環(huán)境因子中溫度(Tem)、全氮(TN)、有機質(zhì)(SOM)、降雨量(Pre)、pH是真菌群落β多樣性的主要影響因子(圖4)，分別解釋了真菌群落組成的8.90%、5.42%、4.73%、4.32%、4.29%(表2)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，大多數(shù)真菌門與有機質(zhì)、pH、全N、降雨量、溫度有顯著相關(guān)性，與RDA分析結(jié)果一致(圖5)。

表2 環(huán)境因子對微生物群落的解釋度

3 結(jié)論與討論

本研究采用高通量測序方法對橡膠林土壤真菌群落組成和多樣性進行了研究，結(jié)果表明，子囊菌門、擔子菌門和子囊菌綱、傘菌綱分別是真菌群落在門水平和綱水平相對豐度最高的類群。此前研究報道，全球采樣尺度上，子囊菌門和擔子菌門是土壤真菌群落的優(yōu)勢菌門，子囊菌綱和傘菌綱是真菌群落的優(yōu)勢類群，與本研究結(jié)果一致[13]。

季節(jié)變化反映了土壤溫度和濕度的變化[32]，土壤微生物群落的多樣性受土壤含水量(WC)驅(qū)動[8,13]，然而，本研究結(jié)果表明，WC和真菌多樣性之間并無顯著的相關(guān)關(guān)系，這是因為土壤水分含量會間接影響微生物活性，高含水量會導(dǎo)致氧氣供應(yīng)不足從而降低有機質(zhì)分解速率，而土壤水分含量低則會降低可溶基質(zhì)的擴散和微生物的遷移能力，從而降低微生物的活性[33-34]。pH與土壤真菌的多樣性顯著正相關(guān)，是橡膠林真菌多樣性最主要的驅(qū)動因子，此結(jié)果與近幾年的研究結(jié)果一致[15,35]。RDA分析結(jié)果表明，環(huán)境因子中，溫度是真菌群落組成最主要的驅(qū)動因子，Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，微生物多樣性與溫度正相關(guān)，呈現(xiàn)出緯度梯度的多樣性，本研究結(jié)果與之一致，而Bahram等[12]的研究結(jié)果表明土壤細菌的多樣性從中緯度向兩極和赤道遞減。不同研究結(jié)果之間存在差異，一方面是因為研究的地理尺度格局和采樣數(shù)量的差異，另一方面是因為相比于自然生態(tài)系統(tǒng)橡膠林生態(tài)系統(tǒng)有其獨特的生存環(huán)境以及微生物生活史的不同[37]。