基于生態(tài)酶化學計量研究小隴山不同植被類型土壤有機碳對微生物磷限制的影響

楊海裕,鄭子龍*,劉小林,李惠萍,高鵬程

(1.甘肅省小隴山林業(yè)科學研究所，甘肅 天水 741020；2.甘肅小隴山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，甘肅 天水 741020；3.甘肅省次生林培育重點實驗室，甘肅 天水 741020；4.西北農(nóng)林科技大學 資源環(huán)境學院，陜西 楊陵 712100)

土壤是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，起著為地上植被提供營養(yǎng)以及協(xié)調(diào)水、肥、氣、熱，保障植被生存生長起著重要作用[1-2]。森林土壤由固、液、氣三相構(gòu)成的復雜物質(zhì)體系，土壤物理、化學以及生物學特性可以決定森林土壤質(zhì)量[3-4]。土壤酶在森林土壤中扮演十分重要的角色，土壤微生物通過細胞胞外酶降解復雜的有機化合物來獲取其自身所需的各種營養(yǎng)[5-6]，因此土壤酶活性成為評價土壤肥力的一個重要指標[7-8]。但是通過對單種酶的分析測定僅僅能揭示樣品之間絕對活性水平的差異，幾乎不能為有關(guān)微生物群落整體行為或營養(yǎng)狀況提供信息。相反，與C、P以及C和N循環(huán)相關(guān)酶的相對活性可以揭示C、N和P獲取相對資源分配的差異[9]。生態(tài)酶化學計量學代表了微生物能夠吸取養(yǎng)分的能力，因此可以用作評估生態(tài)系統(tǒng)能量流、微生物對養(yǎng)分的需求以及土壤養(yǎng)分供應(yīng)的重要指標[10-11]。生態(tài)酶化學計量分析已用于確定半干旱地區(qū)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)以及高山和沙漠盆地生態(tài)系統(tǒng)中的C、N、P限制[12-13]，但較少采用生態(tài)酶化學計量法來研究森林生態(tài)系統(tǒng)中微生物的代謝特征。

目前對小隴山林區(qū)植被類型的研究多集中在土壤理化性質(zhì)和土壤肥力方面，而對微生物的代謝特征等生物學性質(zhì)研究較少。本試驗在甘肅省小隴山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站(以下簡稱：小隴山生態(tài)站)沙壩監(jiān)測區(qū)選取銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林進行生態(tài)酶化學計量分析研究，旨在探討不同植被類型對土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性的影響，探究土壤中理化性質(zhì)的改變對微生物代謝限制的影響，評估各植被類型中微生物生長的C、N、P限制。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地位于甘肅省小隴山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站沙壩監(jiān)測區(qū)，地處天水市秦州區(qū)娘娘壩鎮(zhèn)境內(nèi)(105°54′E，34°07′N)。海拔1 550～2 100 m，平均坡度36°～40°，土壤是以山地棕壤與山地褐土為主。屬于大陸性季風氣候，為暖溫帶濕潤區(qū)，年平均氣溫7.2 ℃，最高氣溫30.3 ℃，最低氣溫-22.4 ℃；年均降水量757 mm；平均相對濕度78%；平均年日照時數(shù)1 553 h；平均年蒸發(fā)量1 012.2 mm；≥10 ℃有效積溫2 480 ℃；初霜期10月16日，終霜期5月4日，無霜期154 d。

1.2 試驗設(shè)計

在小隴山生態(tài)站沙壩監(jiān)測區(qū)選擇銳齒櫟純林、銳齒櫟混交林2種森林類型，設(shè)置4塊面積為20 m×20 m固定觀測樣地。

1.3 樣品采集和參數(shù)計算

2020年8月在樣地選取8個樣點，清除表層枯枝落葉及表層浮土后，從土壤剖面的0～10、10～20、20～30、30～40、40～60 cm處每層采集3個土壤樣品。在每個樣地隨機采取8個土樣，并充分混勻成1個樣品。去除根、落葉、雜物和枯枝后，將每個混勻樣品分為2部分以備將來分析。一部分通過2.0 mm的篩子，并保存在4 ℃下，用于在1周內(nèi)分析細胞外酶的活性。另一部分風干用來分析其理化性質(zhì)。土壤酶活性采用微孔板熒光法測定與C、N、P循環(huán)相關(guān)的5種酶，其中與碳循環(huán)相關(guān)的酶是β-1，4-葡萄糖苷酶(BG)與β-D-纖維二糖水解酶(CBH)；與N循環(huán)相關(guān)的酶是β-1，4-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG)與L-亮氨酸氨基肽酶(LAP)；與P循環(huán)相關(guān)的為酸性磷酸酶(AP)。

微生物代謝限制的定量：微生物代謝限制是通過計算所有未轉(zhuǎn)化酶活性數(shù)據(jù)的矢量長度和角度來量化。C限制用矢量長度表示，計算方法為x2和y2之和的開平方，其中x表示(BG+CBH)/(BG+CBH+AP)；y代表(BG+CBH)/(BG+CBH+NAG+LAP)。矢量角(α)表示微生物代謝受N或P限制，即用原點到點(x，y)延長線的反正切函數(shù)表示。

α=degrees(atan2(x,y))

1.4 統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)處理；使用R v.3.6.1軟件包執(zhí)行相關(guān)性分析，使用IBM SPSS Statistics 21.0進行其他統(tǒng)計分析；使用Amos v.24構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型下的土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分化學計量比

通過對2種植被類型不同土層深度土壤養(yǎng)分測定結(jié)果分析可以看出，不同植被類型和土層深度對土壤養(yǎng)分含量影響很大(P<0.05，表2)。其中有機C與全N含量隨土層深度的增加而降低，而銳齒櫟混交林的平均SOC和TN含量分別比銳齒櫟純林高21.1%和17.3%。在0～20 cm土層，銳齒櫟混交林的TP含量比銳齒櫟純林處理高16.3%，但在10～40 cm土層的平均TP含量比銳齒櫟純林低36.9%。各植被類型之間的營養(yǎng)元素化學計量存在顯著差異(P<0.05)。在0～10 cm土層，銳齒櫟純林的C∶P(120.8±4.6)與N∶P(12.3±0.9)最高，分別為120.8和4.6。銳齒櫟混交林的C∶P隨土層深度的增加而減??；各植被類型的N∶P隨土壤深度增加呈下降的趨勢。在銳齒櫟混交林下，各土層的C∶P與N∶P比率均比銳齒櫟純林高51.0%與42.9%。

2.2 不同植被類型下的土壤酶活性和生態(tài)酶化學計量比

通過對2種植被類型土壤中與C、N、P循環(huán)相關(guān)酶的活性及其化學計量比進行分析(P<0.05，表3)，可以看出，2種植被類型與C、N、P循環(huán)相關(guān)酶活性均隨土層深度增加不斷降低；銳齒櫟純林的各土層平均BG+CBH與AP含量較銳齒櫟混交林分別提高了16.6%和32.6%，最大值分別為(1 141.6±78.1)nmol·g-1·h-1和(1 417.7±87.7)nmol·g-1·h-1，而銳齒櫟混交林各土層的平均NAG+LAP含量較銳齒櫟純林提高了10.3%。銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林的(BG+CBH)∶(NAG+LAP)隨土層深度的增加呈先增加后降低的趨勢，在20～30 cm土層達到最高，最大值分別為2.2和1.6。銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林的(BG+CBH)∶AP隨土層深度的增加呈下降的趨勢，銳齒櫟混交林的平均(BG+CBH)∶AP較銳齒櫟純林提高了14.4%；銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林的(NAG+LAP)∶AP隨土層深度的增加不斷下降，最大值分別為0.6和0.8，且銳齒櫟混交林的平均各土層(NAG+LAP)∶AP比率顯著高于銳齒櫟純林0.5倍。

2.3 不同植被類型土壤細胞外酶化學計量學的載體特征

如圖1A所示，生態(tài)酶的化學計量學載體特征在不同植被類型和土層之間有所不同。所有采樣數(shù)據(jù)點均在(1∶1)直線上方，從而表明土壤微生物群落受到較強的P限制。不同的植被類型和土層對微生物的代謝特性具有強烈的交互作用(P<0.05，圖1B和圖1C)。

除10～20 cm，銳齒櫟純林各土層的矢量長度高于銳齒櫟混交林(圖1B)，銳齒櫟純林各土層的矢量長度較銳齒櫟混交林提高了5.4%；且銳齒櫟純林各土層的矢量角度均顯著高于銳齒櫟混交林(P<0.05，圖1C)。但是，微生物的碳限制(矢量長度)與微生物的磷限制(矢量角度)沒有顯著的線性關(guān)系(圖1D)。線性回歸分析還表明，土微生物C限制隨pH的升高而降低(P<0.05，圖2)。土壤微生物P限制隨著容重的升高而增加，但隨著有機質(zhì)、全N、速效N、速效P、C∶P、N∶P、pH和土壤含水量的升高而降低(P<0.05，圖3和圖4)。

SEM分析確定了土壤物理特性，總有效養(yǎng)分含量和養(yǎng)分比對微生物C和P限制的直接和間接影響。SEM分析微生物養(yǎng)分限制與土壤理化特性之間的關(guān)系(長度，卡方=6.380，P=0.896；角度，卡方=8.549，P=0.741)。pH與土壤含水量和速效N呈負相關(guān)，與土壤容重和全N呈正相關(guān)；土壤容重與有機質(zhì)、全N、速效N呈負相關(guān)；速效N與土壤含水量、有機質(zhì)、全N和全P呈正相關(guān)；而pH對微生物C限制具有消極的總體影響(圖4)。此外，土壤含水量與全N、全P和速效N呈正相關(guān)，而與土壤容重呈負相關(guān)；土壤容重與有機質(zhì)和速效P呈負相關(guān)；全氮與有機質(zhì)、速效N和速效P呈正相關(guān)。土壤容重和全P對微生物P限制具有積極的總體影響，而速效P和有機質(zhì)對微生物P限制具有消極的總體影響(圖4)。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1 不同植被類型對土壤養(yǎng)分的影響 不同植被類型會改變土壤中養(yǎng)分含量，并極大地影響?zhàn)B分的有效性，從而導致微生物代謝受到C和P的相對限制[15]。銳齒櫟混交林輸入了更多的凋落物，增加了腐殖質(zhì)層厚度；與銳齒櫟純林相比，土壤中有機C與全N含量分別提高了8.3%與7.3%，這與王強等[16]、L.Huo等[17]的研究結(jié)果一致。此外本研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機質(zhì)、全N與有效P含量與坡度呈負相關(guān)關(guān)系，與黃安香等[18]研究結(jié)果相似。李昌蘭等[19]的研究表明，土壤養(yǎng)分N、P、K流失分為地表流失和地下流失，主要的影響因子為坡度，表現(xiàn)為隨著坡度的增加流失量增加。有研究結(jié)果表明，受風向、地表徑流的影響，坡度越大，土壤N、P、K含量相對越低[20]。本研究表明銳齒櫟純林39°坡土壤肥力低于銳齒櫟混交林33.5°坡(表1與表2)。微生物C限制與SOC、TN和Olsen-P無顯著線性關(guān)系(P>0.05；圖2)。微生物P限制與有機C、全N、速效N和速效P呈負相關(guān)(P<0.05；圖3)。因此，有機C、N、P對微生物養(yǎng)分限制的影響不同。本研究還發(fā)現(xiàn)，與銳齒櫟純林相比，銳齒櫟混交林平均各土層速效N含量之間無顯著差異，有效P含量提高了116.6%(表2)，而全P下降了17.9%，這是由于有機C分解后增加了土壤中的有效P。研究結(jié)果與Ma等[13]的研究結(jié)果相似。C∶P和N∶P比率與微生物P限制相關(guān)(P<0.05；圖3)，從而表明養(yǎng)分化學計量很大程度地影響了微生物對養(yǎng)分的吸收能力。微生物的養(yǎng)分需求是由微生物生物量的元素化學計量學相對于營養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境利用決定的[21]。土壤水分是能夠影響土壤結(jié)構(gòu)和活性的重要因素[22]，良好的水分條件有利于土壤中有機質(zhì)和全N的分解，在本研究中，銳齒櫟純林較少的C和N的輸入，同時銳齒櫟純林提供了良好的水分條件，造成土壤中有機C含量下降(表2、表4)，限制了微生物的生長[9,14]。

表1 樣地信息

表2 不同植被類型下土壤養(yǎng)分和養(yǎng)分比的雙向方差分析

表3 不同植被類型下細胞外酶活性的雙向方差分析

表4 不同植被類型下土壤理化性質(zhì)的雙向ANOVA分析

3.1.2 不同植被類型對土壤酶活性的影響 CBH能夠促進纖維素的降解，BG能夠?qū)⒗w維二糖水解成葡萄糖[23]。NAG和LAP是與N循環(huán)相關(guān)的關(guān)鍵酶。AP能將有機P水解為可利用的無機P，其活性與土壤P供應(yīng)潛力和P有效性直接相關(guān)[9]。不同植被類型和土層深度都會影響與C、N、P循環(huán)相關(guān)酶的活性(表3)。研究表明，不同森林植被類型土壤酶活性存在顯著差異，且不同土層的土壤酶活性也有一定差異性[24]。植被在不同土層有著不同的養(yǎng)分需求，不同土層的土壤含水率都會影響土壤酶活性。本研究中，銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林處理在0～10 cm土壤含水量是0～50 cm土層含水量的2.3倍和2.2倍，良好的水分加速了土壤有機P的礦化，并促進了植被的生長，因此銳齒櫟純林土壤微生物釋放出更多的磷酸酶分解養(yǎng)分來滿足微生物的代謝(表3、表4)。本研究表明，銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林的酶活性隨土層深度增加不斷下降，銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林0～10 cm土層的BG+CBH與NAG+LAP酶活性是40～60 cm土層的3倍，AP酶活性是40～60 cm土層的2倍，研究結(jié)果與宋霄君等[25]的研究相似。

3.1.3 不同植被類型對微生物體內(nèi)C、N和P有效性的影響 本研究中，土壤微生物的代謝受到土壤有效P的限制(所有數(shù)據(jù)點的角度均>45°，圖1A)。同樣，在其他研究中確定的微生物P限制歸因于酸性土壤中Fe和Al離子的強結(jié)合。水溶性P在酸性土壤中慢慢轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的閉蓄態(tài)P，降低了P的利用率[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，銳齒櫟純林的土壤微生物P限制顯著高于銳齒櫟混交林(圖1C)。銳齒櫟純林的有效P含量顯著低于銳齒櫟混交林(表2)。此外，銳齒櫟純林的土壤含水量與容重高于銳齒櫟混交林(表4)，他們加快了土壤有機C的分解，導致了銳齒櫟純林處理更強烈的微生物P限制。為了應(yīng)對土壤中P素的不足，與N循環(huán)相關(guān)酶活性相比，微生物產(chǎn)生了更多的與P循環(huán)相關(guān)的酸性磷酸酶[28]。除土壤含水量和土壤容重外，土壤有機質(zhì)與全N也是影響P限制的關(guān)鍵因素(圖3A、圖3C)，但是土壤全P與矢量角之間沒有顯著的相關(guān)性(圖3C)，基于C∶P和N∶P值與矢量角之間的負相關(guān)關(guān)系(圖3e、3f)，認為有機P的礦化速率受到C∶P與N∶P的影響，當C∶P與N∶P大時，出現(xiàn)了微生物與植被競爭P的現(xiàn)象，發(fā)生P的生物固定，加重了微生物P限制。這與Ma等[13]的研究結(jié)果一致。酸性土壤中，銳齒櫟混交林適當提高pH值有助于促進鐵、鋁形成氧化物沉淀減少它們對P的固定[28]，從一定程度上降低了微生物P限制。與銳齒櫟純林相比，銳齒櫟混交林下較高的有機C導致較高的有效P含量和較低酸性磷酸酶活性(表2、表3)。

前人研究表明，高C∶(N、P、S)的外加C源年輸入量不會導致土壤有機C含量的增加[29]。本研究中，凋落物的年輸入量顯著增加了土壤有機C含量，以及有機殘渣中釋放了更多的有效P。由于競爭爭奪吸附位點和在Fe、Al、氫氧化物等膠體表面形成保護膜，有機C的增加也降低了土壤對P的吸附潛力[30]。然而，銳齒櫟純林顯著增加了土壤水分和土壤容重，但降低了土壤pH(P<0.05，表4)，從而增強了微生物的活性，加速了有機C的分解以及增加了P的生物固定[31-32]，因此釋放更多的有效P用來減緩土壤微生物的P限制(直接作用為-0.73，圖4)。經(jīng)過長年銳齒櫟純林種植后，土壤有機C含量比銳齒櫟混交林下的土壤有機C降低0.2倍，從而影響了有效P的釋放，并且銳齒櫟純林加速了土壤C的礦化，這不利于森林土壤C的固存。

3.2 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，山地次生林土壤微生物的生長主要受到土壤有效P的限制。銳齒櫟純林與銳齒櫟混交林相比，增加了微生物P的限制，這主要是由于銳齒櫟純林下土壤水和容重的升高加速了土壤有機C的分解，最終增加了土壤微生物受到有效P的限制。在銳齒櫟混交林模式下，由于較多的有機C輸入，降低了土壤中Fe、Al離子對P的吸附，同時凋落物會釋放更多的有效P，因此銳齒櫟混交林減緩了微生物P限制。

此外，微生物的P限制也受到了土壤容重、pH與化學養(yǎng)分計量比的影響，但有機C是土壤微生物P限制的關(guān)鍵因素。本研究通過將次生林植被土壤的理化性質(zhì)與微生物的代謝限制聯(lián)系在一起，從而加深了對土壤養(yǎng)分循環(huán)機理的研究。