一種山梨醇新工藝及其應(yīng)用

汪多仁

(中國(guó)石油吉林石化公司,吉林 132101)

山梨醇是一種六元醇,廣泛存在于自然界的各種水果中,如蘋(píng)果、桃子、棗、李子和梨等。山梨醇是合成維生素C或山梨糖的主要原料[1]。山梨醇雖然具有清爽的甜味,但甜度僅為蔗糖的60%,每克僅含熱量12.6 J,低于其他碳水化合物每克提供的熱量,因此山梨醇常用于減肥或低熱量食品中。此外,山梨醇在人體代謝中不受胰島素的調(diào)節(jié),食用后血糖水平上升緩慢。山梨醇主要是通過(guò)肝臟,在酶的作用代謝下產(chǎn)生果糖,以果糖的形式被人體吸收,因而常被用作糖尿病患者食品中蔗糖的替代品。山梨醇不被口腔內(nèi)的有害細(xì)菌利用,常被添加到口香糖中以預(yù)防齲齒,且具有清涼的甜味,可作為無(wú)糖口香糖中的甜味劑。山梨醇具有保濕和保鮮作用,是最早被允許作為食品添加劑的糖醇之一,用于提高食品的保濕性或作為增稠劑,如在烘焙食品中,山梨醇常用于代替甘油作為保濕劑和賦形劑[2-4],延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。筆者綜述了生物法生產(chǎn)山梨醇的新工藝,以期為生產(chǎn)山梨醇及應(yīng)用提供參考。

1 生 物 法

1.1 改良菌株

工藝過(guò)程:將氧化葡萄糖酸桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度為28～32 ℃、轉(zhuǎn)速為150～180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)6～24 h,將發(fā)酵液離心,收集濕菌,從而獲得菌細(xì)胞。生物轉(zhuǎn)化步驟周期從48 h縮短到36 h[5]。

改進(jìn)葡萄糖酸內(nèi)酯酶活性,可獲得缺乏葡萄糖酸內(nèi)酯酶活性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 29191改良菌株[6]。ATCC 29191在質(zhì)量濃度分別為葡萄糖100 g/L、酵母提取物5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂(7 H2O)0.5 g/L、硫酸亞鐵銨(6 H2O)20 mg/L、生物素1 mg/L和泛酸鈣2 mg/L,pH為7.0,溫度為28 ℃條件下培養(yǎng),離心培養(yǎng)液,并用等滲鹽水8.5 g/L洗滌,以收獲生物質(zhì)。用pH為7的10%溶液處理生物質(zhì),以增加滲透性。

1.2 材料與底物

制備水溶液3 mL,內(nèi)含濕重0.5 g且經(jīng)甲苯處理的生物質(zhì)及0.81 g葡萄糖和0.81 g果糖,對(duì)應(yīng)于每種糖的濃度為1.5 mol/L,添加Na2CO3濃度為2 mol/L,反應(yīng)溫度為39 ℃,pH為6.2。在420 min后,底物轉(zhuǎn)化率為96%,生成的葡萄糖內(nèi)酯和山梨醇的質(zhì)量基本相等。

首先將生物質(zhì)從反應(yīng)混合物中分離出來(lái)后,用0.33 mL上清液凍干除去水;然后干燥材料并溶解于3 mL甲醇中,用作氫化步驟的起始材料/底物,等同于葡萄糖內(nèi)酯和山梨醇等摩爾混合物。

1.3 氫 化

催化氫化反應(yīng)條件:起始材料總量為1 mmol,KOMe摩爾分?jǐn)?shù)為5%,絡(luò)合物摩爾分?jǐn)?shù)為0.5%,甲醇總體積為3 mL,溫度為70 ℃,時(shí)間為16 h,在H2O中進(jìn)行HPLC分析,葡萄糖內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為山梨醇的轉(zhuǎn)化率為95%以上。用醇類(lèi)溶劑效果最佳,用乙醇溶劑轉(zhuǎn)化率為96%,用甲醇溶劑山梨醇的轉(zhuǎn)化率為98%[7-9]。

在氫化步驟中進(jìn)行測(cè)試,使用不同底物與催化劑摩爾比(S/C)的影響,將不同量的底物用于反應(yīng)(標(biāo)準(zhǔn)條件),即使用基于過(guò)渡金屬的絡(luò)合物,S/C在5 000～20 000時(shí),轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%[10-11]。

1.4 Parabacteroides goldsteinii生產(chǎn)山梨醇

1.4.1 菌 株

工業(yè)制造雖然可以得到大量的山梨醇,但是在得到山梨醇原料后,需要經(jīng)過(guò)很多的提純步驟,會(huì)產(chǎn)生工業(yè)廢物,在純化過(guò)程中,山梨醇的質(zhì)量不均,應(yīng)用于其他產(chǎn)品時(shí)會(huì)帶來(lái)麻煩。

新工藝中使用的MTS01新型益生菌為parabacteroidesgoldsteinii(簡(jiǎn)稱(chēng)P.goldsteinii)專(zhuān)性厭氧菌,保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen[12]。2018年10月29日,編號(hào)為DSM 32939。P.goldsteinii在Whitley DG250厭氧培養(yǎng)箱(英國(guó)Don Whitley)中37 ℃培養(yǎng)48 h,厭氧環(huán)境混合厭氧氣體(包括CO2為10%,N2為80%,H2為10%),用厭氧指示劑(Oxoid,英國(guó))確認(rèn)環(huán)境是否達(dá)到厭氧條件。P.goldsteinii液體培養(yǎng)基為NIH巰基乙酸(TGC Ⅱ)(購(gòu)自美國(guó)BD公司,編號(hào)225710),固體培養(yǎng)基為厭氧血瓊脂平板(Ana.BAP)(購(gòu)自CREATIVE LIFESCIENCES,臺(tái)灣)。P.goldsteinii長(zhǎng)期保存在-80 ℃冰箱中,保護(hù)液為25%甘油。不需要特殊的冷卻處理,可以冷凍干燥儲(chǔ)存,以穩(wěn)定活性。

新工藝中的山梨醇由P.goldsteinii菌株的莢膜多糖(CPS)基因產(chǎn)生;莢膜多糖基因位于P.goldsteinii菌株的多糖基因區(qū)A,P.goldsteinii菌為P.goldsteiniiDSM32939。

1.4.2 對(duì)金氏擬桿菌莢膜多糖合成基因區(qū)的預(yù)測(cè)

新工藝預(yù)測(cè)是在金氏擬桿菌MTS01的莢膜多糖合成基因區(qū),其中細(xì)菌莢膜的多糖合成基因區(qū)由多個(gè)基因組成,包括糖基轉(zhuǎn)移酶、翻轉(zhuǎn)酶、多糖輸出蛋白和多糖聚合酶,大部分基因方向相同。因此,新工藝遵循在金氏副桿菌MTS01全基因組中,尋找莢膜多糖合成基因區(qū)的原則。

在新工藝的P.goldsteinii全基因組中,有9個(gè)片段的CPS區(qū)域,是莢膜多糖基因區(qū)域的序列片段;CPS區(qū)域A的核酸序列與脆弱擬桿菌NCTC9343株多糖A(PSA)基因區(qū)域的wcfR基因和wcfS基因相似,CPS A區(qū)核酸序列與Bacteroidetesfragilis桿菌中wcfR基因和wcfS基因的蛋白序列同源性分別為38.6%,69.3%。Bacteroidetesfragilis的wcfR基因和wcfS基因主要負(fù)責(zé)莢膜多糖的合成,因此將P.goldsteiniiMTS01中的該基因區(qū)域定義為一個(gè)莢膜多糖合成基因區(qū)域。

通過(guò)偶聯(lián)制備含有基因A區(qū)的質(zhì)粒,用同源基因重組的方法將質(zhì)粒嵌入wcfR基因中,破壞編碼結(jié)構(gòu)。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),證實(shí)該質(zhì)粒序列已成功嵌入P.goldsteinii的wcfR基因并破壞DNA結(jié)構(gòu)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈反應(yīng)也證實(shí),當(dāng)P.goldsteiniiwcfR基因的DNA結(jié)構(gòu)插入質(zhì)粒時(shí),RNA合成會(huì)被破壞。

1.4.3P.goldsteinii莢膜多糖合成基因區(qū)突變株的構(gòu)建與確認(rèn)

突變株MTS01-wcfR′的構(gòu)建方法:使用引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增wcfR基因A)P.goldsteiniiMTS01和擴(kuò)增wcfR基因片段在兩端都含有EcoRV的切割位點(diǎn)。使用EcoRV將擴(kuò)增的wcfR基因片段插入到帶有EcoRV裂解位點(diǎn)的pKNOCK-bla-ermGb質(zhì)粒中,該質(zhì)粒攜帶ermG基因?yàn)樘禺愋阅退幓?用于篩選細(xì)菌是否成功攜帶在質(zhì)粒中。

為確認(rèn)新工藝的金氏P.goldsteiniiMTS01的莢膜多糖基因是否已被成功破壞,篩選出具有莢膜多糖突變的P.goldsteiniiMTS01-wcfR′(Mutant,M)突變株和P.goldsteiniiMTS01(野生型,W)的天然菌株分別與引物對(duì)A,B和C進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。如果P.goldsteiniiwcfR基因被成功破壞(即成功嵌入pKNOCK-bla-ermGb質(zhì)粒中),則突變菌株將在天然菌株中750 bp處可見(jiàn)核酸產(chǎn)物。即用引物對(duì)A進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng),在750 bp可見(jiàn)的核酸產(chǎn)物只能在天然菌株中看到,在P.goldsteiniiMTS01-wcfR′中看不到;用引物對(duì)B或C進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng),在750 bp處可見(jiàn)的核酸產(chǎn)物只能在突變菌株中看到,在天然P.goldsteiniiMTS01中看不到。結(jié)果表明:同源基因重組方法成功地將質(zhì)粒序列嵌入到新工藝P.goldsteiniiMTS01的wcfR基因中,造成該基因DNA結(jié)構(gòu)的破壞。

將新工藝的金氏副桿菌MTS01同時(shí)與構(gòu)建的pKNOCK-bla-ermGb質(zhì)粒的大腸桿菌(E.coli)S17-1λ-pir混合,2種菌在好氧環(huán)境下置于濾紙上偶聯(lián)36 h,質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到新工藝P.goldsteiniiMTS01中對(duì)應(yīng)金氏副桿菌MTS01基因組上的wcfR基因片段后發(fā)生同源重組,從而破壞wcfR基因,獲得在莢膜多糖合成基因中發(fā)生突變的P.goldsteiniiMTS01-wcfR′的突變株后,用氯霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL和紅霉素質(zhì)量濃度為10 μg/mL的羊血木耳培養(yǎng)板篩選MTS01-wcfR′突變株。

1.4.4 破壞P.goldsteinii的wcfR基因?qū)NA合成的影響

新工藝基于wcfR基因設(shè)計(jì)了3個(gè)引物分別為Primer 1,Primer 2,Primer 3。首先,使用RNeasy?MiniKit(購(gòu)自Qiagen,Valencia,CA,USA)分別從上述P.goldsteiniiMTS01-wcfR′的突變株和P.goldsteiniiMTS01的天然菌株中提取總RNA后,使用Quant Ⅱ快速逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(購(gòu)自Tools,Taiwan)分別以Primer 1,Primer 2,Primer 3進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以提取總RNA為模板獲得互補(bǔ)DNA(cDNA)后用聚合酶鏈反應(yīng)比較突變體P.goldsteiniiMTS01-wcfR′菌株和天然菌株MTS01的差異,即用第一輪聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)的特殊PCR,以提高特異性和產(chǎn)品信號(hào)的靈敏度。

Primer 1和Primer 2用于設(shè)計(jì)擴(kuò)增天然wcfR基因,其中:Primer1為pg-wcfR-out R′-R加pg-wcfR-out-F,所得產(chǎn)物為863 bp;Primer 2為PSA-wcfR-out FF加pg-wcfR-R,所得產(chǎn)物應(yīng)為647 bp。因此,用Primer 1和Primer 2進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈反應(yīng)只會(huì)擴(kuò)增天然wcfR基因片段,而不會(huì)擴(kuò)增被破壞的wcfR基因。此外,Primer 3設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增pKNOCK-bla-ermGb(PSA-KO)質(zhì)粒上的耐藥基因,Primer 3為ermG-F加ermG-R,所得產(chǎn)物應(yīng)為350 bp。用Primer 3進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈反應(yīng)可以成功獲得cDNA產(chǎn)物,在天然菌株中沒(méi)有具有相同信號(hào)的任何產(chǎn)物;用Primer 2進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和巢式聚合酶鏈反應(yīng)可以成功獲得在P.goldsteiniiMTS01天然菌株中約647 bp處可見(jiàn)的cDNA產(chǎn)物,突變體中沒(méi)有任何具有相同信號(hào)的產(chǎn)物。

1.5 金氏副桿菌的代謝物分析

1) 提取每個(gè)菌株中的代謝物。首先將100 μL樣品(即天然菌株MTS01和突變菌株MTS01-wcfR′的培養(yǎng)基)置于1.5 mL離心機(jī)中,加入0.35 mL甲醇提取溶劑后加入10 μL阿東醇為內(nèi)標(biāo)[13],在搖床上均勻混合30 s,在冰水浴中超聲10 min。將樣品在4 ℃、12 000 r/min下離心15 min,然后將每個(gè)樣品的上清液0.34 mL取出放到新的1.5 mL離心機(jī)中,獲得提取液在真空濃縮器中進(jìn)行干燥,將60 μL純化后的代謝物加入甲氧胺鹽試劑(溶于20 mg/mL吡啶)中,輕輕混勻,然后在80 ℃烘箱中反應(yīng)30 min[14]。將80 μLN,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)加入含有體積分?jǐn)?shù)為1%三甲基氯硅烷(TMCS)的樣品中,混合物在70 ℃下反應(yīng)1.5 h[15],用氣相色譜對(duì)該儀器進(jìn)行分析。

2) 用氣相色譜儀分析比較金氏副桿菌MTS01天然菌株與金氏副桿菌MTS01-wcfR′突變菌株的液體培養(yǎng)代謝物在莢膜多糖基因中的差異。P.goldsteiniiMTS01天然菌株代謝物中山梨醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于P.goldsteiniiMTS01-wcfR′突變株的質(zhì)量分?jǐn)?shù),說(shuō)明新工藝的P.goldsteiniiMTS01可以產(chǎn)生山梨醇,山梨醇的產(chǎn)生受參與調(diào)節(jié)莢膜多糖的基因的調(diào)節(jié)[3]。

3)P.goldsteiniiMTS01的天然菌株和莢膜多糖P.goldsteiniiMTS01-wcfR′的突變株的液體培養(yǎng)代謝物的分析結(jié)果顯示:在P.goldsteiniiMTS01天然菌株、P.goldsteiniiMTS01-wcfR′突變株和空白液體培養(yǎng)基對(duì)照組的3種培養(yǎng)基的代謝物中,共檢測(cè)到2 703個(gè)分析信號(hào),其中底線(xiàn)為空白液體培養(yǎng)基對(duì)照組信號(hào),頂線(xiàn)為金氏副桿菌MTS01天然菌株信號(hào),中線(xiàn)為金氏副桿菌MTS01-wcfR′突變株。檢測(cè)到的每個(gè)信號(hào)與數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行比較,3種培養(yǎng)基中檢測(cè)到的山梨醇信號(hào)有顯著差異。然而,由于檢測(cè)到的大量信號(hào),不容易直接區(qū)分每組之間的差異,因此3組中檢測(cè)到的山梨醇的表達(dá)水平以柱狀呈現(xiàn)。

1.6 結(jié)果與分析

新工藝提供生產(chǎn)山梨醇的方法:1) 提供P.goldsteinii菌株;2) 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)P.goldsteinii菌株;3) 將P.goldsteinii菌株與疏水底物接觸形成山梨醇。

新工藝中構(gòu)建并確認(rèn)了金氏副桿菌的突變株的莢膜多糖合成基因區(qū)(MTS01-wcfR′),優(yōu)選破壞該基因以在P.goldsteiniiMTS01中產(chǎn)生莢膜多糖,確認(rèn)基因區(qū)域莢膜多糖合成基因區(qū)域細(xì)菌。該基因?yàn)樘禺愋阅退幓?用于篩選細(xì)菌是否成功并攜帶在質(zhì)粒中。

對(duì)3組液體培養(yǎng)代謝物的差異進(jìn)行分析和比較后發(fā)現(xiàn):P.goldsteiniiMTS01天然菌株代謝物中山梨醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于突變株。P.goldsteiniiMTS01-wcfR′菌株,其中以空白液體培養(yǎng)基對(duì)照組的山梨醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為比較標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果,表明利用P.goldsteini生產(chǎn)山梨醇受參與調(diào)節(jié)莢膜多糖基因的調(diào)控[3]。

新工藝的同源基因重組方法成功地將質(zhì)粒嵌入到P.goldsteiniiMTS01的wcfR基因中,調(diào)節(jié)P.goldsteinii控制基因生產(chǎn)山梨醇,并根據(jù)需要控制山梨醇的生產(chǎn)。

1.7 提純方法

取麥芽糖醇提余液1 kg,加入0.4 g葡萄糖糖化酶,60 ℃恒溫糖化24 h,得到糖化液,測(cè)得在糖化液中的低聚糖醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了40%。向上述糖化液中加入4 g干酵母,30 ℃發(fā)酵65 h,得到發(fā)酵液,測(cè)得其中的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。通過(guò)脫色過(guò)濾去除發(fā)酵液中的酵母,再經(jīng)膜分離處理后分別得到稀液和濃液,稀液為山梨醇液,濃液為液體多元醇。其中,在稀液和濃液中測(cè)得組分如下:稀液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%,75%,10%,0.17%;濃液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為45%,13%,35%,0.09%[4]。新工藝在于對(duì)麥芽糖醇提余液進(jìn)行有效利用,提高附加值,而且方法簡(jiǎn)單實(shí)用,成本低[16-18]。

2 山梨醇產(chǎn)品的應(yīng)用

2.1 制備糖漿

新工藝涉及制備山梨醇糖漿的方法:1) 水解轉(zhuǎn)化糖溶液中的蔗糖溶液;2) 通過(guò)模擬移動(dòng)床色譜法從轉(zhuǎn)化糖溶液中分離出葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%,優(yōu)選果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92%;3) 將所述葡萄糖糖漿氫化為山梨醇糖漿,還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于0.2%,甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1%,干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%。山梨醇糖漿的總還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于0.2%,甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1%,干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%。

反應(yīng)混合物:碳酸鈣質(zhì)量為15 mg,500 mmol/L的TEA/NaOH 8.0質(zhì)量為50 μg,葡萄糖質(zhì)量為25 mg,果糖質(zhì)量為25 mg,10 mmol/L的NAD+質(zhì)量為20 μg,10 mmol/L的NADP+質(zhì)量為10 μg,NADPH依賴(lài)性木糖還原酶為4 U,NADP依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶為5 U。

將反應(yīng)混合物在1.5 mL帶透氣蓋的玻璃容器中培養(yǎng)16 h,轉(zhuǎn)速為850 r/min,使用高效液相色譜法分析反應(yīng)產(chǎn)物,果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與體積分?jǐn)?shù)比值從最初的5%增加到6.9%,此時(shí)葡萄糖幾乎完全消耗[19-20]。

2.2 制造口香糖

2.2.1 方法與晶體尺寸

制造口香糖要選擇不同的山梨醇粉末比率,第一山梨醇晶體尺寸為0.1～0.37 μm,第二山梨醇晶體尺寸為0.9～1.5 μm。其中,第二山梨醇粉末包含的山梨醇晶體具有比第一山梨醇粉末的晶體尺寸大至少3倍的預(yù)定晶體尺寸;將第一山梨醇粉末和第二山梨醇粉末與膠基混合,形成流變特性在目標(biāo)范圍內(nèi)的口香糖,以降低生產(chǎn)成本[21-22]。

口香糖組分包含膠基、山梨醇粉末和親水性軟化劑。山梨醇是第一山梨醇晶體和第二山梨醇晶體的組合。第一山梨醇晶體的數(shù)量與第二山梨醇晶體的數(shù)量比為50∶50[23-24]?？谙闾腔|(zhì)可以有很大的變化,膠基包括用于口香糖和泡泡糖的膠基,樹(shù)膠基的合適聚合物包括天然、合成彈性體和橡膠,口香糖基料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～30%。

樹(shù)膠基組分包含常規(guī)彈性體增塑劑,用量為膠基質(zhì)量的45%～70%(質(zhì)量比)。樹(shù)膠基中有效量的常規(guī)添加劑,如增塑劑或軟化劑,用量是膠基量的3%～20%(質(zhì)量比)。當(dāng)膠基中存在蠟時(shí),可軟化聚合物彈性體混合物,并提高膠基的彈性,因此所用蠟的熔點(diǎn)優(yōu)選溫度為45～55 ℃,低熔點(diǎn)蠟為石蠟,優(yōu)選約7%～9.5%(質(zhì)量比)。除低熔點(diǎn)蠟外,具有較高熔點(diǎn)的蠟用量高達(dá)膠基質(zhì)量的5%(質(zhì)量比)。這種高熔點(diǎn)蠟包括蜂蠟、植物蠟聚乙烯蠟和微晶蠟等。膠基可包括有效的填充劑、填料或助劑,占膠基量的20%～30%(質(zhì)量比)。

除水不溶性口香糖基外,典型的口香糖組分還包括水溶性散裝部分和一種或多種調(diào)味劑。水溶性組分包括散裝甜味劑、高強(qiáng)度甜味劑、調(diào)味劑、親水性軟化劑、乳化劑、著色劑、酸化劑、填料、抗氧化劑和其他傳統(tǒng)口香糖添加劑?？谙闾墙M分中使用多種添加劑,包括甜味劑、高強(qiáng)度甜味劑、風(fēng)味調(diào)節(jié)劑或增強(qiáng)劑、香料/調(diào)味品、著色劑、藥物、口腔護(hù)理劑、喉嚨護(hù)理劑、呼吸清新劑、礦物佐劑、填充劑、酸化劑、緩沖劑和感光劑填充劑,用量達(dá)口香糖組分的40%～65%(質(zhì)量比)。

合適的乳化劑包括蒸餾單甘酯合適的親水性軟化劑包括甘油、山梨醇糖漿、麥芽糖醇糖漿、氫化淀粉水解物(HSH)、水、丙二醇及其組合。軟化劑質(zhì)量可以是口香糖質(zhì)量的2%～12%[25-26]。

口香糖組分在熔化后放置在標(biāo)準(zhǔn)混合器中,添加剩余成分并徹底混合1～20 min,使用常規(guī)技術(shù)將混合物形成的最終形狀如擠壓、軋制和切割成棒狀,鑄造成顆粒,然后選擇性地涂覆或壓制成片劑。

2.2.2 多個(gè)供應(yīng)商提供的山梨醇晶體尺寸測(cè)量

使用X射線(xiàn)衍射儀(Rigaku)和Cu-Kα輻射,通過(guò)粉末X射線(xiàn)衍射對(duì)晶體尺寸進(jìn)行XRD測(cè)量和掃描電子顯微鏡(SEM)測(cè)定,從不同供應(yīng)商處可獲得至少24種不同山梨醇晶體尺寸粉末[27]。

2.2.3 工藝配方

按以下質(zhì)量配比制備,準(zhǔn)確度為±2%:脫脂牛奶584.1 g,全脂奶粉36 g,脫脂奶粉37.1 g,山梨醇154.8 g,明膠3.6 g,香蘭素0.1 g,植物原料50 g,固體植物脂肪50 g,加水目標(biāo)產(chǎn)品1 000 g。在需要時(shí),以對(duì)流方式切割和干燥,直至達(dá)到中等含水量。然后在加熱條件下保持原料,直到溫度不低于100 ℃,并減壓至大氣值,同時(shí)植物原料膨脹。在微波場(chǎng)中進(jìn)行干燥,直到干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于85%,并用固體植物脂肪上釉。將制備的脫脂乳、干全脂乳、干脫脂乳、山梨醇、明膠、香蘭素和飲用水按配方比例混合,經(jīng)巴氏滅菌、均質(zhì)、冷卻后,加入釉面植物原料?；旌衔锝?jīng)過(guò)冷凍、包裝和硬化以生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品。

2.3 制備光降解口香糖

2.3.1 聚醋酸乙烯酯嵌段甲基苯基硅烷的制備

制備嵌段共聚物,將5 g相對(duì)重均分子質(zhì)量為32 600且多分散指數(shù)為3.0的聚甲基苯基硅烷添加到干凈干燥的Schlenk管中,向試管中加入15 mL二甲苯和95 g甲基丙烯酸甲酯。通過(guò)6次凍融循環(huán)去除氧氣,同時(shí)用干燥氮?dú)獯祾?。然后將混合物加熱?5 ℃,用200～350 nm的紫外線(xiàn)(UV)光照射約10 min,混合物開(kāi)始聚合?；旌衔镌?5 ℃下照射120 min,然后用200～350 nm的紫外線(xiàn)照射10 min;混合物在95 ℃下維持120 min,然后暴露于氧氣源中以停止反應(yīng)。通過(guò)冷甲醇沉淀得到共聚物產(chǎn)物,進(jìn)一步用冷的甲醇和水清洗聚合物產(chǎn)品。凝膠滲透色譜分析證實(shí)形成了重均分子質(zhì)量為150 000、多分散指數(shù)為3.5的共聚物,嵌段共聚物含有甲基苯基硅烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%和聚醋酸乙烯酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%。

2.3.2 實(shí)例1和對(duì)比1膠基的擬定制備

為制備膠基,首先確定膠基組分如表1所示,按照表1制備母料(咀嚼彈性體)。彈性體,即聚異丁烯和丁基橡膠按表1所示的比例放入標(biāo)準(zhǔn)混合器中,將彈性體加熱至130 ℃,加熱的彈性體混合約15 min,然后逐漸添加熔點(diǎn)為70.5 ℃氫化棉籽油,并與彈性體混合約90 min后,將單硬脂酸甘油酯添加到混合器中,再與彈性體混合20 min以使混合物均勻。制備母料后,從母料中制備膠基[28-29]。

2.3.3 制備和配方

1) 膠基。將醋酸乙烯酯和甲基苯基硅烷的嵌段共聚物添加到另一標(biāo)準(zhǔn)混合器中,加熱至130.5 ℃后,根據(jù)2.3.2節(jié)工藝制備的母料添加到嵌段共聚物中,混合約15 min。將熔點(diǎn)約為45.5 ℃氫化棉籽油添加到混合器中,混合10 min,然后添加三乙酸甘油酯混合10 min,再加入滑石粉混合10 min。

2) 制備對(duì)比1膠基。在另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)混合器中加入聚醋酸乙烯酯,加熱至約130.5 ℃后,將根據(jù)上述工藝制備的母料添加到聚醋酸乙烯酯中,混合約15 min。將熔點(diǎn)為45.5 ℃氫化棉籽油,添加到混合器中,混合10 min,然后添加三乙酸甘油酯混合10 min,再加入滑石粉混合約10 min。

口香糖組分采用實(shí)例1和對(duì)比1進(jìn)行,結(jié)果如表2所示。

表2 口香糖組分

根據(jù)表2中列出的組分物制備實(shí)施例1和對(duì)比1口香糖[7-8]。為了制備口香糖,相應(yīng)的口香糖基料在約175.5 ℃的溫度下熔化后放置在標(biāo)準(zhǔn)混合器中,添加額外成分,即山梨醇、甘露醇、木糖醇、乙?；瘑胃术?、甘油、冷卻劑、膠囊食品級(jí)酸、卵磷脂、粉末和液體香料、乙酰磺胺K和阿斯巴甜,徹底混合20 min[29]。在口香糖形成后24 h測(cè)量,結(jié)果表明:在口香糖產(chǎn)品中包括多元醇,例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇和其他氫化低聚糖,多元醇可用作口香糖中的“糖替代品”。這些糖替代品的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)在消費(fèi)者口中發(fā)酵形成可以侵蝕牙釉質(zhì)的產(chǎn)品,因此山梨醇以及其他多元醇通常用于無(wú)糖產(chǎn)品。此外,山梨醇還可用作填充劑[30-31]。

2.4 制備罐頭

2.4.1 糖漿制劑

將檢查過(guò)的水果去皮裝入容器,在不銹鋼糖漿罐中測(cè)量定量的水,以產(chǎn)生含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79%水的最終糖漿。工藝過(guò)程:1) 在溫度為70 ℃中,添加足夠的液體山梨醇,生產(chǎn)含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.75%的山梨醇糖漿。2) 糖漿加熱到160 ℃,保持30 min,優(yōu)選添加檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%,抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%和任何人工甜味劑(如三氯蔗糖)(以最終糖漿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))。3) 充分混合糖漿,糖漿轉(zhuǎn)移到糖漿儲(chǔ)存罐中,與填充的水果混合。

2.4.2 不加糖糖漿制劑

水果去皮裝入容器,在不銹鋼糖漿罐中測(cè)量定量的水,以產(chǎn)生含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71%的水的最終糖漿。工藝過(guò)程:1) 在溫度為70.0 ℃中,添加足夠的液體山梨醇,生產(chǎn)含山梨醇糖漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.75 %;2) 糖漿加熱到160 ℃,保持30 min,優(yōu)選添加檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%,抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%和任何人工甜味劑(如三氯蔗糖)(以最終糖漿的量分?jǐn)?shù)計(jì));3) 充分混合糖漿,將糖漿轉(zhuǎn)移到糖漿儲(chǔ)存罐中,并與填充的水果混合[32]。

將水性山梨醇用于口香糖中,與結(jié)晶山梨醇相比,水溶液中的山梨醇是一種更便宜的優(yōu)質(zhì)替代。

3 結(jié) 論

在山梨醇新工藝生產(chǎn)方面:新工藝的P.goldsteiniiMTS01是一種多功能新型益生菌,經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)分析,在新工藝的P.goldsteiniiMTS01的整個(gè)基因組中,發(fā)現(xiàn)的9段CPS區(qū)域可能是莢膜多糖基因區(qū)域的序列片段;其中,由于CPS區(qū)域A攜帶與脆弱擬桿菌菌株NCTC9343的多糖A(PSA)基因區(qū)域中的wcfR基因和wcfS基因相似的核酸序列,主要負(fù)責(zé)莢膜多糖的合成。通過(guò)接合制備含有基因區(qū)域A的質(zhì)粒,并使用同源基因重組方法將質(zhì)粒嵌入wcfR基因以破壞編碼結(jié)構(gòu)。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng),證實(shí)質(zhì)粒序列已成功嵌入金氏副桿菌的wcfR基因,并導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)破壞。已有結(jié)果表明:P.goldsteiniiMTS01可以產(chǎn)生山梨醇,山梨醇的產(chǎn)生受調(diào)控莢膜多糖的基因調(diào)控。在應(yīng)用方面,山梨醇是一種典型的增塑劑多元醇,用于替代多元醇乙二醇、丙二醇、赤蘚糖醇和季戊四醇等。首選的增塑劑應(yīng)有足夠的沸點(diǎn),在擠出機(jī)的加工溫度高時(shí)較穩(wěn)定。增塑劑首選甘油、甘油酸酯或兩者的混合物。增塑劑占總質(zhì)量的1%～30%,山梨醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～30%時(shí)最好。山梨醇是高效、無(wú)毒,可降解型增塑劑,可直接替代傳統(tǒng)的鄰苯二甲酸類(lèi)增塑劑,已獲許在歐盟各國(guó)出售與使用,可用在對(duì)衛(wèi)生要求較高的與食品接觸高分子材料、玩具和醫(yī)療器械中,還可用于商用瓶蓋、密封內(nèi)層薄膜以及其他與食品接觸性塑料制品中。山梨醇無(wú)激素刺激、完全可生物降解并無(wú)不良口感及氣味,即使被誤吃入人體內(nèi)也無(wú)大礙,可以代謝排出。