反相液相色譜法測(cè)定閩產(chǎn)千斤拔染料木苷及染料木素含量

江思思，顏寶玲，張 淼，黃澤豪，劉小芬

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

中藥材千斤拔別名一條根、竹結(jié)豆、鉆地風(fēng)、山豆根等，具有祛風(fēng)除濕、消腫解毒等功效，在福建全省各地多有分布，以沿海較多[1]。《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》(2012 年版)中收載千斤拔為豆科植物千斤拔(Flemingia prostrata)和大葉千斤拔(Flemingia macrophylla)的干燥根[2]。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、顯微、薄層色譜鑒別等，缺少含量測(cè)定等分析內(nèi)容?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，黃酮類化合物是千斤拔的主要化學(xué)成分，染料木苷和染料木素是其大豆異黃酮類中2 種含量較高的主要成分[3—5]。因此，本文以閩產(chǎn)千斤拔作為試材，建立其染料木苷及染料木素含量測(cè)定的方法，對(duì)福建不同產(chǎn)地的千斤拔藥材20 批樣品進(jìn)行測(cè)定，為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

千斤拔藥材采自福建各地，共20 批次，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉小芬副教授鑒定，S1～S16 為千斤拔的根，S17～S20 為大葉千斤拔的根(表1)。標(biāo)本保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。不同產(chǎn)地千斤拔陰干，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，備用。

表1 閩產(chǎn)千斤拔樣品信息Table 1 Sample information of flemingiae radix produced in Fujian

1.2 儀器與試劑

Waters-e2695-2998 高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；BSA224S 萬(wàn)分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；XS105 微量天平(梅特勒托利多集團(tuán))；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；TDL-40B 低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli-Q Direct 8 超純水機(jī)(Millipore 公司)；DFY-C-500 快速開(kāi)蓋萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(大德中藥機(jī)械有限公司)。染料木苷對(duì)照品(上海源葉生物，HPLC 級(jí)，含量≥98%，批號(hào)：A29J10L94211)；染料木素對(duì)照品(上海源葉生物，HPLC 級(jí)，含量≥98%，批號(hào)：H30A9Z69019)；乙腈(HPLC 級(jí)，德國(guó)默克有限公司)；磷酸(HPLC 級(jí)，上海麥克林)；Milli-Q Direct 8 超純水系統(tǒng)處理的去離子水。

1.3 方法

1.3.1 混合對(duì)照品溶液制備

取染料木苷和染料木素對(duì)照品各5.0 mg，用無(wú)水甲醇制成0.2 mg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1 mL，用無(wú)水甲醇定容至10 mL容量瓶，制成0.02 mg·mL-1染料木苷和染料木素混合對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6]確定甲醇濃度、料液比、提取時(shí)間為因素，各因素設(shè)3 水平，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)(表2)。取不同基原千斤拔(S16、S18)進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最佳提取工藝，按最佳提取工藝試驗(yàn)驗(yàn)證3 次，RSD 均小于3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 千斤拔提取工藝正交試驗(yàn)因素及其水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

稱取千斤拔粉末0.5 g，按正交試驗(yàn)最佳工藝提取，用離心機(jī)4000 r·min-1離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

采用Atlantis T3 高效液相色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(時(shí)間梯度：0→10→50→60→110→1 20 min；濃度梯度：5%→15%→40%→60%→100%→5% A)，流速1.2 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，采用DAD 檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(210～800 nm)。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品母液配制成0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。染料木苷和染料木素的回歸方程分別為y=41889839x-4134 (R2= 0.9991)、y=67377321x-9208 (R2=0.9992)，兩成分均在 0～0.012 mg·mL-1濃度下線性關(guān)系良好。

1.4.2 精密度試驗(yàn)

取1.3.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，染料木苷和染料木素峰面積的RSD 分別為0.07%和0.2%，表明儀器精密度良好。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一千斤拔樣品(S16) 6 份，按1.3.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)得染料木苷和染料木素的RSD 分別為1.24%和2.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(樣品S16)，分別于0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積，染料木苷和染料木素峰面積的RSD 分別為2.17%和1.15%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.4.5 加樣回收試驗(yàn)

稱取已測(cè)兩成分含量的千斤拔樣品(S16) 0.5 g 共6份，精密加入等量染料木苷和染料木素對(duì)照品，按1.3.2項(xiàng)下方法平行制備供試溶液，進(jìn)樣測(cè)定，染料木苷和染料木素的平均回收率分別為102.6%和101.5%，RSD 為0.57%和0.86%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以千斤拔藥材的總峰面積作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明各因素對(duì)提取效果的影響程度為料液比(B)＞提取時(shí)間(A)＞甲醇濃度(C)；料液比(B)有顯著影響(P＜0.05)，而甲醇濃度(A)、提取時(shí)間(C)無(wú)顯著影響(P＞0.05) (表3、表4)。不同基原千斤拔最佳提取工藝略有不同，千斤拔以80%甲醇提取為好，大葉千斤拔以60%甲醇提取較優(yōu)，二者最佳料液比和提取時(shí)間一致，分別為1:25 g·mL-1和45 min。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化千斤拔超聲提取工藝：不同基原千斤拔按各自最佳百分濃度甲醇提取，料液比1:25 g·mL-1，超聲提取45 min。

表3 千斤拔(S16)提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test result of extraction from Flemingia prostrata (S16)

表4 大葉千斤拔(S18)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test result of extraction from Flemingia macrophylla (S18)

2.2 色譜條件

按1.3.3 色譜條件進(jìn)樣，染料木苷和染料木素的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000。采用DAD檢測(cè)器對(duì)染料木苷對(duì)照品溶液和染料木素對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(210～800 nm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染料木苷和染料木素分別在258.8 nm 和260 nm 處有最大吸收，同時(shí)供試品溶液在260 nm 處基線較平穩(wěn)，雜質(zhì)峰干擾較少，故選取260 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)(圖1、圖2)。

圖1 對(duì)照品溶液和樣品溶液HPLC圖Fig. 1 HPLC diagram of reference solution and sample solution

圖2 染料木苷和染料木素的紫外吸收光譜圖Fig. 2 UV absorption spectra of genistin and genistein

2.3 不同產(chǎn)地千斤拔染料木苷和染料木素含量測(cè)定

福建不同產(chǎn)地千斤拔的染料木苷和染料木素含量見(jiàn)表5。閩產(chǎn)千斤拔中染料木苷含量在0～0.119 mg·g-1之間，平均含量為0.018 mg·g-1；染料木素含量在0.065～0.17 mg·g-1之間，平均含量為0.115 mg·g-1。閩產(chǎn)千斤拔中染料木素含量較染料木苷高。染料木苷和染料木素可能通過(guò)糖基化和水解反應(yīng)互相轉(zhuǎn)化[7]，故應(yīng)進(jìn)一步比較二者的總量限度。二者總含量在0.039～0.281 mg·g-1之間，平均含量為0.133 mg·g-1，以該值下調(diào)20%則為0.1 mg·g-1，故建議擬定本品染料木苷和染料木素的總含量不低于0.1 mg·g-1。

表5 福建不同產(chǎn)地千斤拔染料木苷和染料木素含量Table 5 Contents of genistin and genistein in flemingiae radix from different habitats of Fujian province

不同產(chǎn)地千斤拔兩成分總含量(同一產(chǎn)地取總含量平均值)由高到低依次是三明尤溪(0.161 mg·g-1)、福州平潭與龍巖上杭(0.154 mg·g-1)、莆田秀嶼(0.137 mg·g-1)、漳州南靖(0.135 mg·g-1)、漳州東山(0.130 mg·g-1)、福州長(zhǎng)樂(lè)(0.129 mg·g-1)、龍巖武平(0.123 mg·g-1)、漳州華安(0.109 mg·g-1)、泉州南安(0.039 mg·g-1)(表5)。從產(chǎn)地來(lái)看，三明尤溪所產(chǎn)的千斤拔質(zhì)量最優(yōu)，福州平潭和龍巖上杭次之，不同產(chǎn)地千斤拔中染料木苷和染料木素總含量差異較小，沿海和內(nèi)陸沒(méi)有明顯差異，表明福建省內(nèi)不同產(chǎn)地千斤拔藥材質(zhì)量水平較穩(wěn)定。

本次收集的千斤拔藥材有千斤拔和大葉千斤拔兩個(gè)基原，其中千斤拔兩種成分平均總含量為0.133 mg·g-1，大葉千斤拔兩種成分平均總含量為0.131 mg·g-1，兩者差異較小，由此可見(jiàn)多個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)將兩個(gè)基原都收錄作為藥材千斤拔是合理的。本次收集的千斤拔藥材有野生和栽培兩個(gè)來(lái)源，其中S1～S10 為野生品、S11～S20 為栽培品。野生品兩成分平均總含量為0.140 mg·g-1，栽培品兩成分平均總含量為0.122 mg·g-1，表明野生品的質(zhì)量略優(yōu)于栽培品，野生資源可在資源保護(hù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)利用。

2.4 聚類分析

采用組內(nèi)連接聚類法分析20 批千斤拔樣品兩成分含量的相關(guān)性(圖3)。聚類分析結(jié)果顯示，以d=10 劃分，20 批樣品共聚為2 類。福州平潭產(chǎn)千斤拔(S4)兩成分含量較高，被單獨(dú)聚為一類，可能與該地千斤拔的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)；其他產(chǎn)地樣品被聚為一類，表明福建不同產(chǎn)區(qū)千斤拔質(zhì)量較穩(wěn)定，差異不明顯。

圖3 閩產(chǎn)千斤拔20 批樣品聚類分析Fig. 3 Cluster analysis on 20 batches of samples of flemingiae radix from Fujian

3 討論

3.1 提取方法的確定

已有學(xué)者對(duì)千斤拔的提取方式進(jìn)行考察，表明提取方法對(duì)提取效果有顯著影響，綜合比較，超聲提取法更適合于千斤拔黃酮類成分提取[6,8—9]。吳拾保等[10]考察了水和不同濃度甲醇、乙醇對(duì)千斤拔黃酮類成分提取的影響，結(jié)果表明甲醇提取率最高。因此，本研究選用超聲提取法并采用甲醇作為提取溶劑對(duì)供試品進(jìn)行制備，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)甲醇濃度、料液比和提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)選，最終確定超聲提取千斤拔的最佳工藝。該方法快速簡(jiǎn)便易行，可操作性強(qiáng)，有利于樣品的批量提取分析。

3.2 不同產(chǎn)地千斤拔藥材染料木苷及染料木素含量差異

千斤拔藥材產(chǎn)云南、四川、貴州、廣西、廣東、海南、江西、福建等地，主產(chǎn)區(qū)為廣西、云南和福建[11]。本研究對(duì)福建10 個(gè)產(chǎn)地的20 批千斤拔藥材中染料木素和染料木苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，省內(nèi)不同產(chǎn)地千斤拔藥材兩種成分含量差異較小，質(zhì)量水平相對(duì)穩(wěn)定。研究結(jié)果具有一定代表性，可為今后千斤拔地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供依據(jù)。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地千斤拔藥材中染料木苷和染料木素含量差異顯著，不同產(chǎn)區(qū)中以廣西產(chǎn)千斤拔兩成分總量最高，提示廣西可能是千斤拔的適宜生長(zhǎng)區(qū)[12—15]。但藥材次生代謝產(chǎn)物的含量是動(dòng)態(tài)變化的，產(chǎn)地的海拔、氣候、土壤等條件，藥材的生長(zhǎng)年限、貯藏年限等均可能對(duì)千斤拔藥材中次生代謝產(chǎn)物變化產(chǎn)生影響，因此值得進(jìn)一步探究。