改良大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型的再評(píng)價(jià)及應(yīng)用研究

張志琴，王振飛，何大偉，陸軻，郝彥明，李翀

1.昆山市第一人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)，江蘇 昆山 215316；2.徐州市中心醫(yī)院骨科，江蘇 徐州 221009；3.昆山市第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 昆山 215316

胸腹主動(dòng)脈瘤術(shù)后有較高截癱發(fā)生率[1-2]。由于術(shù)中臨時(shí)阻斷了動(dòng)脈血供造成脊髓缺血，研究普遍認(rèn)為脊髓缺血缺氧在脊髓繼發(fā)性損傷中具有重要作用。對(duì)于脊髓損傷病理機(jī)制研究及治療方法的改進(jìn)均有賴(lài)于成功制作動(dòng)物模型。目前，脊髓損傷模型種類(lèi)較多，包括機(jī)械性、血管性、光化學(xué)性損傷等[3]，其中缺血損傷又包括夾閉腹主動(dòng)脈法、阻斷腰動(dòng)脈法、氣囊栓塞法等。有學(xué)者認(rèn)為，大鼠脊髓的血供節(jié)段性不強(qiáng)，應(yīng)用大鼠制作脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)模型并不十分理想。但較多文獻(xiàn)報(bào)道，脊髓缺血損傷模型具有可操作性強(qiáng)、行為學(xué)穩(wěn)定、病理改變一致等優(yōu)點(diǎn)，而且大鼠脊髓血供與人相似[4]。在制作大鼠SCII 模型時(shí)，大多學(xué)者選取左腎動(dòng)脈下夾閉腹主動(dòng)脈[5-6]。據(jù)報(bào)道，該模型只能造成第三腰椎以下范圍缺血，并不能造成高位脊髓缺血。有學(xué)者對(duì)該模型進(jìn)行了改良，通過(guò)夾閉右腎動(dòng)脈上腹主動(dòng)脈近心端制作SCII，該模型可以造成T13節(jié)段以下脊髓缺血，但缺血程度、時(shí)限及可以造成的病理?yè)p傷尚沒(méi)有一致的認(rèn)識(shí)，因此該模型的評(píng)價(jià)顯得十分重要。本研究擬建立并評(píng)價(jià)一種改良大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，為脊髓缺血再灌注損傷相關(guān)研究提供可靠、穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)雄性 SD 大鼠36 只，體質(zhì)量300～400 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)提供。實(shí)驗(yàn)經(jīng)昆山市第一人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。隨機(jī)分為7 組，A1、A2 每組3 只，B1、B2、B3、B4、B5 每組6 只。A1 組不結(jié)扎腹主動(dòng)脈僅行單純手術(shù)操作，心臟灌注Microfil(Flow Tech，USA)。A2組結(jié)扎腹主動(dòng)脈后心臟灌注Microfil。B1組為空白對(duì)照組，B2、B3 組夾閉腹主動(dòng)脈60 min 后開(kāi)放腹主動(dòng)脈分別再灌注24 h、48 h；B4、B5 組夾閉腹主動(dòng)脈90 min后開(kāi)放腹主動(dòng)脈分別再灌注24 h、48 h；觀察大鼠下肢功能改變并取脊髓做病理檢測(cè)。

1.2 改良缺血再灌注模型的建立及方法 模型制作參考既往文獻(xiàn)介紹的方法，即選擇性?shī)A閉大鼠右腎動(dòng)脈上極腹主動(dòng)脈近心端造成脊髓缺血。2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，消毒鋪巾，術(shù)中予以體溫檢測(cè)，維持大鼠體溫恒定。取腹部正中切口，打開(kāi)腹膜，暴露腹主動(dòng)脈，使用50 g 夾閉力的動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈。A1 組動(dòng)物麻醉后打開(kāi)胸腔及腹腔，剪斷下腔靜脈，進(jìn)行體循環(huán)灌注，應(yīng)用含有肝素鈉的生理鹽水左心室灌流約300 mL至肝臟變白，下腔靜脈流出清涼液體。然后應(yīng)用4%的多聚甲醛灌流約250 mL 進(jìn)行組織內(nèi)固定，大鼠表現(xiàn)為全身肌肉痙攣，鼠尾翹起，至大鼠全身僵硬。將配好的Microfil 20 mL 加壓注射至左心室，灌注成功后明顯可見(jiàn)肝臟以及腹腔腸系膜毛細(xì)血管內(nèi)充盈黃色造影劑。待Microfil 凝固后取出T11～L6脊髓組織，置于4%的多聚甲醛中保存。A2 組在灌注Microfil前夾閉腹主動(dòng)脈，其余步驟同A1 組。同步輻射螺旋顯微CT于中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所進(jìn)行。B1 組為空白對(duì)照組，打開(kāi)腹腔后隨即關(guān)閉腹腔。B2、B3 組夾閉腹主動(dòng)脈 60 min 再灌注24 h、48 h。動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)雙下肢完全癱瘓，針刺下肢有反應(yīng)，但肢體不能活動(dòng)者列入研究對(duì)象。術(shù)后每天給予慶大霉素8 萬(wàn)單位肌肉注射預(yù)防感染。再灌注24 h、48 h后2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，肝素鈉生理鹽水及4%多聚甲醛心臟灌流，取出脊髓后置于4%多聚甲醛中保存。B4、B5 組夾閉腹主動(dòng)脈90 min 后再灌注24 h、48 h。其余手術(shù)操作同B2、B3組。

1.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià) 采用BBB 評(píng)分于術(shù)后6 h、12 h、24 h和48 h對(duì)B組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，包括0～21級(jí)，完全功能缺失為0分，完全正常鼠為21分，評(píng)價(jià)的內(nèi)容主要包括大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)軀干位置及穩(wěn)定性步態(tài)協(xié)調(diào)性爪的置放足趾間隙以及尾的位置等。

1.4 組織病理學(xué)檢測(cè) 4%多聚甲醛浸沒(méi)組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，依次修塊切片攤片烤片后保存?zhèn)溆?。HE 染色：切片脫蠟至水，蘇木素染色3～8 min，流水稍沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化30 s(觀察分化效果)，流水稍沖洗；1%氨水溶液返藍(lán)30 s，流水稍沖洗；鏡檢著色滿(mǎn)意后入伊紅染液染色1～3 min；梯度酒精各5 min，二甲苯，中性樹(shù)脂封片。尼氏染色：切片脫蠟至水，入0.5%甲苯胺藍(lán)染液染3 min，水洗，用95%酒精分化，顯微鏡下控制，烤干，中性樹(shù)膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用SNK 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓動(dòng)脈血供 L1節(jié)段脊髓動(dòng)脈分布情況見(jiàn)圖1。A1 組水平面可見(jiàn)位于腹側(cè)面的脊髓前動(dòng)脈，和成對(duì)的脊髓后動(dòng)脈，正常脊髓動(dòng)脈系統(tǒng)血供豐富；A2 組水平面顯示當(dāng)夾閉右腎動(dòng)脈上腹主動(dòng)脈近心端時(shí)，兩條脊髓后動(dòng)脈被完全阻斷。從側(cè)面觀機(jī)與上面觀對(duì)比可見(jiàn)腹主動(dòng)脈夾閉前后L1節(jié)段的脊髓后動(dòng)脈被阻斷，僅脊髓前動(dòng)脈未被阻斷。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，了解到脊髓前動(dòng)脈來(lái)源于椎動(dòng)脈的顱內(nèi)分支，通過(guò)阻斷腹主動(dòng)脈無(wú)法阻斷該動(dòng)脈。通過(guò)血管鑄型CT 三維重建，顯示夾閉腹主動(dòng)脈后，自L(fǎng)1以下的脊髓大部分血流被阻斷。

圖1 夾閉腹主動(dòng)脈前后的節(jié)段脊髓血管矢狀位及水平位三維重建圖像

2.2 各組大鼠的BBB 評(píng)分比較 如表1 所示，與 B1 組比較，B2、B3 組 BBB 評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B3 組比 B2 組有升高趨勢(shì)，6 h、12 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B4、B5 組同 B1 組比較，BBB 評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；同 B2、B3 組同時(shí)間點(diǎn)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B5 組評(píng)分較 B4 有升高趨勢(shì)。

表1 各組大鼠的BBB評(píng)分比較()

表1 各組大鼠的BBB評(píng)分比較()

注：與6 h組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與12 h組比較，cP＜0.01，dP＜0.05；與24 h組比較，eP＜0.01。

組別60 min 90 min B1組B2組B3組B4組B5組F值t值P值6 h 21.00±0 4.02±0.54 4.14±0.35 12 h 21.00±0 10.10±0.71a 10.76±0.92a 24 h 21.00±0 14.02±0.76c 14.40±0.52c 48 h 21.00±0-17.00±0.71e 6 h 21.00±0 12 h 21.00±0 24 h 21.00±0 48 h 21.00±0--------------5.06±0.34e-----47.29 0.000 1 696.60-0.000 1 82.02-0.000 1 54.21-0.000 1 5.657 0.004 8 1.84±0.34 2.00±0.35 1 526-0.000 1 1.90±0.34a 3.14±0.33b 1 532-0.000 1 3.90±0.34c 4.20±0.36d 1 183-0.000 1

2.3 病理檢測(cè) 如圖2所示，B1組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)多樣化，胞體較大，細(xì)胞質(zhì)呈嗜酸性粉染，細(xì)胞核大呈嗜堿性藍(lán)染，核仁明顯。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈小圓形或橢圓形，數(shù)量較多，細(xì)胞較小，細(xì)胞質(zhì)淡粉染，細(xì)胞核小而深染，核仁不明顯，細(xì)胞間質(zhì)呈粉色淡染。再灌注24 h、48 h時(shí)后可見(jiàn)脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、嗜酸性增加。隨缺血時(shí)間及阻斷時(shí)間的延長(zhǎng)，其損傷程度逐漸加重。如圖3 所示，尼氏體受染后呈塊狀或顆粒狀，核周?chē)崾象w顆粒較大，近邊緣處較小而細(xì)長(zhǎng)。在神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失，因此根據(jù)尼氏體受染情況和數(shù)量差異，可以判斷神經(jīng)元受損程度。對(duì)照組、B1組脊髓尼氏染色神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)基本正常。缺血60 min再灌注24 h、48 h，缺血90 min再灌注24 h、48 h組脊髓病理改變逐漸加重，且以脊髓前灰質(zhì)受損更明顯。B2、B3 組脊髓組織病理顯示運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元腫脹，核仁尚清楚、深染，中央性尼氏小體腫脹，排列松散；B4、B5 部分尼氏小體溶解或消失。

圖2 各組大鼠缺血前后的脊髓組織HE染色結(jié)果(100×)

圖3 各組大鼠缺血前后的脊髓組織尼氏染色結(jié)果(100×)

3 討論

自從ZIVIN等[7]以?shī)A閉兔腎動(dòng)脈下腹主動(dòng)脈建立脊髓缺血再灌注損傷模型以來(lái)，各種改良的模型不斷涌現(xiàn)。伍亞民等[8]通過(guò)選擇性阻斷家兔腰動(dòng)脈模擬出不同程度的損傷，避免了夾閉腹主動(dòng)脈而造成的下肢及腹腔臟器的缺血損傷。CHENG 等[9]由家兔右股動(dòng)脈插入Swan-Ganz 球囊導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈，并在動(dòng)脈造影X射線(xiàn)監(jiān)視下插至腎動(dòng)脈起始部，通過(guò)充氣和排氣復(fù)制脊髓缺血再灌注模型。SCII模型逐漸引入狗、大鼠等試驗(yàn)動(dòng)物[10-11]。大鼠因接近人類(lèi)脊髓血供情況，而且價(jià)格適宜，易于飼養(yǎng)及管理而被廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究。有學(xué)者應(yīng)用2F Fogarty帶囊導(dǎo)管插入鼠脊髓胸主動(dòng)脈造成脊髓缺血。另有有較多研究應(yīng)用夾閉大鼠左腎動(dòng)脈下腹主動(dòng)脈造成脊髓缺血，均獲得良好效果。然而，由于夾閉左腎動(dòng)脈下腹主動(dòng)脈僅平脊髓L4～5位置，造成脊髓缺血范圍較局限，所以該模型并不是一個(gè)十分理想的SCII模型。因此，有學(xué)者對(duì)該模型進(jìn)行了改良，夾閉右腎動(dòng)脈上腹主動(dòng)脈近心端以造成脊髓更大范圍的缺血損傷[12]。目前，改良模型在造成脊髓缺血前后的血供情況及缺血后脊髓組織病理改變等資料仍然缺乏。該研究應(yīng)用脊髓血管鑄型三維重建技術(shù)及脊髓組織病理觀察重新評(píng)估該模型的可靠性及穩(wěn)定性。

脊髓動(dòng)脈同步輻射CT 三維重建圖像顯示了夾閉腹主動(dòng)脈前后T13節(jié)段以下脊髓動(dòng)脈血供分布情況，為夾閉腹主動(dòng)脈后脊髓血供分布提供了客觀依據(jù)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料我們了解到，未被阻斷的動(dòng)脈分支來(lái)源于椎動(dòng)脈的顱內(nèi)分支，向下走行至腰膨大并逐漸變細(xì)，證實(shí)了有學(xué)者認(rèn)為的大鼠脊髓血供節(jié)段性不強(qiáng)的觀點(diǎn)。同時(shí)也證實(shí)了該模型能夠阻斷T13以下節(jié)段脊髓大部分動(dòng)脈供應(yīng)。BBB評(píng)分顯示，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，BBB評(píng)分呈下降趨勢(shì)，表明缺血時(shí)間越長(zhǎng)，脊髓損傷越重。再灌注48 h較24 h評(píng)分有升高趨勢(shì)，顯示再灌注24 h 后脊髓損傷有逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)。脊髓尼氏染色能較好地反映灰質(zhì)的病理改變情況，神經(jīng)損傷表現(xiàn)為神經(jīng)元尼氏體淡染或消失。缺血90 min 組較缺血60 min同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元損傷數(shù)量明顯增多，提示神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度與缺血時(shí)間呈正相關(guān)。HE 染色結(jié)果同尼氏染色一致。有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)主動(dòng)脈阻斷的手術(shù)患者進(jìn)行死亡率回顧分析，結(jié)果顯示神經(jīng)功能受損的嚴(yán)重程度與主動(dòng)脈阻斷時(shí)間呈正相關(guān)[13]。

綜合分析脊髓動(dòng)脈三維CT 重建圖像、大鼠行為學(xué)評(píng)分、脊髓組織病理結(jié)果，該模型成功造成了脊髓T13以下節(jié)段缺血損傷，而且行為學(xué)及病理學(xué)改變穩(wěn)定，神經(jīng)損傷程度與缺血時(shí)限有明顯相關(guān)性，即不同的缺血時(shí)間造成了不同程度的損傷。該模型也有不足之處：夾閉更高位置的腹主動(dòng)脈造成了腹腔臟器更大范圍的缺血損傷，增大了大鼠術(shù)后死亡率。該模型也具有更多優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易于獲得、易于管理、脊髓血管解剖接近人等。綜上，該改良模型簡(jiǎn)易可控，具有推廣價(jià)值。