MMP-3-1171基因多態(tài)性與新疆地區(qū)漢族和維吾爾族骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

陳家瀚，李彥奇，王鑫，史晨輝

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科中心，新疆 石河子 832000)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的慢性致殘性關(guān)節(jié)疾病[1]，其病變主要累積于關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)并逐漸向周?chē)羌败浗M織蔓延，造成關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨及軟骨下骨的持續(xù)性破壞，滑膜炎反復(fù)出現(xiàn)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙消失與關(guān)節(jié)畸形。膝關(guān)節(jié)是OA最常見(jiàn)的累及部位，主要臨床表現(xiàn)以疼痛及活動(dòng)受限為主，亦是OA患者主要就診的原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界OA患者已達(dá)約3億人，其中65歲以上人群OA的患病率甚至達(dá)到50%，已經(jīng)成為中國(guó)第四大致殘性疾病，造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本損失[2-3]。雖然OA主要與人體衰老有關(guān)，但它也與多種風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)，包括遺傳易感性、生物遺傳因素、性別、肥胖、運(yùn)動(dòng)、創(chuàng)傷等[4]，且OA的患病率亦在不同地區(qū)，不同民族存在差異[5-6]。目前骨性關(guān)節(jié)炎的治療推薦以綜合治療為主，包括物理、心理和(或)藥物治療[7]，但其主要目的均是以減少關(guān)節(jié)疼痛，延緩疾病進(jìn)展為主，對(duì)于晚期患者只能通過(guò)關(guān)節(jié)置換來(lái)恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，因此，對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的早期預(yù)防和診斷變得日益重要[8]。

多項(xiàng)研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶族群(MMPs)與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)主要是通過(guò)降解重塑細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix,ECM)參與骨性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程[9-10]。Abd-Allah等研究報(bào)道埃及人群中基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)啟動(dòng)子區(qū)-11715A/6A基因多態(tài)性可能是OA的相關(guān)易感因素[11]，且5A等位基因頻率明顯高于亞洲人群的基因頻率。而Sittisak Honsawek等[12]認(rèn)為其多態(tài)性與泰國(guó)人群OA并無(wú)關(guān)聯(lián)。因此，筆者推測(cè)MMP-3-11715A/6A基因多態(tài)性可能存在不同民族差異性，且其基因多態(tài)性可能是OA的相關(guān)易感因素。本研究旨在通過(guò)基因檢測(cè)技術(shù)，研究MMP-3-11715A/6A基因多態(tài)性和新疆部分地區(qū)漢族人群及維族人群OA之間的關(guān)系，尋找漢族、維族關(guān)于OA方面的基因的差異性。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象

選取2019年10月至2020年10月在石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院、圖木舒克、喀什市第三師人民醫(yī)院、51團(tuán)醫(yī)院關(guān)節(jié)科住院及門(mén)診確診的OA患者為研究對(duì)象，其中漢族OA患者111例(年齡在50～85歲之間，平均年齡59.66歲)，維族OA患者105例(年齡在50～80歲之間，平均年齡57.61歲)。對(duì)照組選取相同時(shí)間采集的門(mén)診及體檢健康的患者作為研究對(duì)象，其中漢族NOA對(duì)象217例(年齡在50～79歲之間，平均年齡57.61歲)；維族健康對(duì)象201例(年齡在50～76歲之間，平均年齡57.28歲)。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)根據(jù)2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南的診療標(biāo)準(zhǔn)，OA組的診斷經(jīng)臨床檢查(癥狀、體征、X線/CT)確診；(2)居住在新疆地區(qū)的漢族及維吾爾族OA患者及同期體檢對(duì)象；(3)年齡高于50歲；(4)患者或其家屬對(duì)本研究知情并簽署相關(guān)的知情同意書(shū)。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

詢問(wèn)采集者既往病史，通過(guò)病史判斷排除繼發(fā)性O(shè)A，任何類(lèi)型的系統(tǒng)性炎癥，任何類(lèi)型的自身免疫性疾病，任何類(lèi)型的惡性疾病的患者。

1.2 主要儀器與試劑

PCR熱循環(huán)儀(Bio-Rad PCR Thermal Cycler，America)，低溫高速離心機(jī)(Beck Man Microfuge 20，America)，F(xiàn)-90型多功能暗箱紫外透射儀，紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop，America)2%瓊脂糖凝膠，凝膠成像分析儀；血液基因組DNA試劑提取盒(TianGen Biotech，Beijing)，限制性內(nèi)切酶PsyⅠ(SibEnzyme，Russia)，rs3025058基因PCR上下游引物(BioMed，Beijing)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

用EDTA-Na2收集管靜脈采集所有研究對(duì)象血液標(biāo)本約4 mL，采集完畢后放置于低溫冷凍冰箱保存，按照血液基因組試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行DNA提取制作，提取完畢的DNA樣本檢測(cè)DNA純度，收集純度合格樣品繼續(xù)保存于冷凍冰箱，對(duì)純度不合格的樣品重新提取DNA。

1.3.2 MMP-3基因擴(kuò)增

PCR引物序列委托BioMed基因公司設(shè)計(jì)合成。正向引物：5′-CAG AGG TTT CAC TAT GTT GCC CAG G-3′；反向引物：5′-ATT AGA GCT GCC ACA GCT TCT ACA C-3′。本研究的反應(yīng)體系:加入2 μL的PCR 緩沖液，1.2 μL的MgCl2+溶液，2.5 uL的DNA聚合酶，0.5 μL的dNTPs，目標(biāo)DNA 100 ng，2.5 μL上游引物、2.5 μL下游引物，剩余dH2O加至20 μL。本研究所使用的反應(yīng)條件：94 ℃ ×10 min，94 ℃ ×30 s，53 ℃ ×30 s，72 ℃ ×45 s，完成循環(huán)35次，72 ℃×7 min。紫外透射儀檢測(cè)凝膠電泳結(jié)果，通過(guò)限制性內(nèi)切酶PsyⅠ在37 ℃恒溫水浴過(guò)夜后鑒定其基因型(圖1)，隨機(jī)抽取部分樣本進(jìn)行基因測(cè)序，與酶切結(jié)果比對(duì)驗(yàn)證(圖2)。

圖1 3種不同基因型的凝膠電泳圖

圖2 MMP-3-1171位點(diǎn)基因型測(cè)序圖

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 參與者數(shù)量分析

本研究共納入634名參與者，其中漢族人群骨性關(guān)節(jié)炎患者111例(33.84%)，漢族人群對(duì)照組217例(66.16%)，維吾爾族人群骨性關(guān)節(jié)炎患者105例(34.31%)，維吾爾族人群對(duì)照組201例(65.69%)，收集所有測(cè)試結(jié)果。

2.2 一般特征資料比較

漢族骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組之間的一般計(jì)數(shù)和計(jì)量資料均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.01)，維族骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組間年齡、身高、體重、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.01)，維族骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組的 BMI 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.024，P<0.01)(表1)。

表1 一般資料比較

2.3 凝膠電泳結(jié)果

將提取的DNA加樣至2%瓊脂糖凝膠電泳中跑樣并在凝膠成像儀中成像觀察并記錄。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PsyⅠ在37 ℃水浴過(guò)夜后，再次通過(guò)凝膠成像儀觀察并鑒定其基因型。其中6A/6A基因型含有129 bp 1個(gè)條帶；5A/6A基因型含有129 bp、96 bp、32 bp 3個(gè)條帶；5A/5A基因型者，只含有96 bp、32 bp 2個(gè)條帶(圖1)。

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

根據(jù)H-W定律各民族骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組中基因位點(diǎn)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組遺傳穩(wěn)定，屬于同一群體(表2)。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡差異性檢驗(yàn)

2.5 MMP-3-1171 5A/6A位點(diǎn)基因的多態(tài)性與漢族和維族骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，其中維族人群中MMP-3-11715A/6A的基因型和等位基因頻率在骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.317和10.648和，P<0.01)，且與6A等位基因相比，5A等位基因顯著提高維族OA人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.833，95%CI=1.271～2.645)。漢族OA組與維族OA組之間MMP-3-11715A/6A基因型及等位基因頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=11.206和8.526，P<0.01)，其中維族OA患者的5A基因型頻率(35%)明顯高于漢族患者(23%)，且維族OA患者M(jìn)MP-3-11715A等位基因可以顯著增加維族OA患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.833，95%CI=1.271～2.645)(表3)。

表3 不同基因型與等位基因頻率的相互比較

2.6 維族MMP-3-1171位點(diǎn) 5A/6A 等位基因頻率與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

以維族MMP-3-11715A/6A等位基因頻率(等位基因5A=1，等位基因6A=0)、BMI為自變量，以骨性關(guān)節(jié)炎為因變量(OA=1，NOA=0)，采用多因素邏輯回歸模型校正文組人群的BMI后分析，結(jié)果顯示MMP-3-1171-5A等位基因可增加骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.793，95%CI=1.270～2.532)(表4)。

表4 維族人群多因素 Logistic 回歸分析結(jié)果

3 討論

目前，對(duì)于OA的遺傳病因及分子機(jī)制仍是研究熱點(diǎn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)也稱(chēng)基質(zhì)溶解素(stromelysin1)，定位人類(lèi)染色體11q22.3基質(zhì)金屬蛋白酶基因簇，是一種可由多種人體細(xì)胞分泌的細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)肽酶，是在OA軟骨中表達(dá)最多的MMPs之一，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，并通過(guò)水解作用激活各種MMPs，以及在軟骨蛋白多糖釋放中起到重要作用[10-13]。因此，MMP-3的過(guò)度表達(dá)可以通過(guò)水解激活其他MMPs和影響細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)造成骨性關(guān)節(jié)炎的病理環(huán)境。多項(xiàng)研究表明，MMP-3在早期和中期骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)及血清中的水平呈高表達(dá)，并且MMP-3的表達(dá)與OA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14-16]。

有關(guān)MMP-3基因啟動(dòng)子1171位點(diǎn)5A/6A基因多態(tài)性于1996年首次由Ye等[17]報(bào)道，其最先發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與多種心血管疾病相關(guān)，如腦梗死，急性冠脈綜合征，急性腦卒中等，后該單核苷酸多態(tài)性(SNP)被證實(shí)與其它多種疾病存在相關(guān)性。根據(jù)報(bào)道，啟動(dòng)子區(qū)1171位點(diǎn)的5A/6A基因可能與MMP-3的表達(dá)水平存在相關(guān)性，其中6A等位基因可能造成水解酶活性減少?gòu)亩鴮?dǎo)致MMP-3轉(zhuǎn)錄水平下降，而5A等位基因相較于6A不會(huì)降低關(guān)節(jié)腔及血清中的MMP-3水平[18]，因此可能進(jìn)一步促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生與發(fā)展。Abd-Allah等人首次報(bào)道埃及人MMP-3-11715A/6A基因多態(tài)性與OA存在易感性關(guān)系[11]，而Sittisak Honsawek等人[12]認(rèn)為其多態(tài)性與泰國(guó)人群OA并無(wú)關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果顯示，我國(guó)新疆地區(qū)漢族和維族的基因多態(tài)性分布頻率，均以6A/6A基因型分布為主。在OA組中，維族5A等位基因頻率(35.2%)明顯高于漢族(22.5%)，統(tǒng)計(jì)學(xué)存在差異(χ2=8.526，P<0.01)。在NOA組中，漢族5A等位基因頻率(17.1%)與維族(22.9%)相似,與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的蒙古人種，如漢族(20%)和日本人(12%～21%)頻率相似[19-20]，明顯低于歐羅巴人種如埃及(52%)和英國(guó)人(50%)的報(bào)道[11]。提示該基因的多態(tài)性存在人種分布差異[21]，可能影響該基因單核苷酸多態(tài)性相關(guān)疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。維吾爾族作為新疆人口數(shù)第一的民族，其基因型頻率與亞洲人群的基因型相似，但在兩組骨性關(guān)節(jié)炎人群中，維族5A基因占比卻顯著高于漢族人群，這說(shuō)明維族可能對(duì)于MMP-3-11715A基因存在相關(guān)易感性，但與人群分布無(wú)關(guān)。

關(guān)于MMP-3-11715A/6A在漢族與維族人群中的易感性，本研究顯示，維吾爾族人群中OA組的基因型及等位基因頻率與NOA組的基因型及等位基因頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.317和10.648，P<0.01)，通過(guò)多因素邏輯回歸分析校正維吾爾族人群的BMI影響，結(jié)果顯示5A等位基因是維吾爾族骨性關(guān)節(jié)炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.793，CI=1.270 ～2.532)，這提示攜帶5A基因維吾爾族人群患骨性關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)增高，這可能是由于攜帶5A等位基因的維族人群關(guān)節(jié)內(nèi)MMP-3的表達(dá)水平較高。但是研究結(jié)果表明攜帶5A等位基因的漢族OA人群與NOA人群無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是由于漢族與維族之間飲食文化及生活習(xí)慣等其他風(fēng)險(xiǎn)因素影響有關(guān)，也可能與漢族5A基因攜帶者數(shù)量較少，研究樣本量較小有關(guān)，限制了相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)功效，存在一定局限性。這種民族之間的基因差異，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量，多中心采集患者數(shù)據(jù)來(lái)得到更具有代表性的數(shù)據(jù)信息?？傊m然OA主要受年齡，體重等因素影響，但遺傳因素也起了不容忽視的作用，MMP-3-1171位點(diǎn)5A等位基因可能增加維族人群OA的患病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制值得深入研究。