新疆發(fā)現(xiàn)甜菜新病害甜菜黃萎病

趙志強(qiáng)，張盧慧，趙全新，郭慶元

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國(guó)最大的甜菜生產(chǎn)區(qū)，也是我國(guó)北方最大的甜菜糖制糖基地[1]。2018年，全區(qū)甜菜種植面積已達(dá)57 260 hm2，占全國(guó)種植總面積的26.49%；全區(qū)甜菜總產(chǎn)量為424.73×104t，占全國(guó)總產(chǎn)量的37.66%[2]。2016年以來(lái)，在新疆多個(gè)地區(qū)的甜菜上發(fā)現(xiàn)了一種新病害，可以造成甜菜葉片褪綠、黃化、萎蔫，直至枯死，且半葉發(fā)病者居多。查明引起新疆甜菜黃萎癥狀的病原，研究病害性質(zhì)，需采集病樣，分離純化，運(yùn)用柯赫氏法則驗(yàn)證及對(duì)病原物形態(tài)觀察和分子鑒定，研究該病原及所致病害類別，對(duì)該病有效防治有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在新疆甜菜產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為普遍或?yàn)楹^大的病害有根腐病、立枯病、褐斑病、白粉病和叢根病等[3]。甜菜黃萎病的發(fā)生也有報(bào)道，但迄今國(guó)內(nèi)對(duì)甜菜黃萎病的認(rèn)識(shí)一直是將其作為植原體病害來(lái)理解的[4-5]。由于植原體病害在病原鑒定上存在一定的難度，國(guó)內(nèi)有關(guān)甜菜黃萎病的報(bào)道多以病害的發(fā)生調(diào)查和防控為主，對(duì)其病原菌的研究較少[4-5]。國(guó)外曾報(bào)道，變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)均為甜菜黃萎病的病原[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆部分甜菜種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種與許多作物真菌性黃萎病癥狀類似的甜菜病害，葉片常表現(xiàn)為黃化、萎蔫，直至枯死，且以半葉黃化居多，而國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)對(duì)此尚無(wú)報(bào)道。需研究該病病原及病名?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類為基礎(chǔ)，結(jié)合核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)、核糖體大亞基(Large subunit rDNA, LSU)及肌動(dòng)蛋白(Actin, ACT)基因進(jìn)行多基因系統(tǒng)學(xué)分析，研究該病原物分類地位，并為該病定名，為該病發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防治技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年8月在新疆伊寧縣、昌吉市周邊和察布查爾縣等地調(diào)查甜菜病害，從伊犁州伊寧縣阿熱吾斯塘鄉(xiāng)、察布查爾縣奶牛場(chǎng)周邊及昌吉市周邊采集多份具有典型黃萎癥狀的病葉樣品。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法對(duì)采集的甜菜病樣分離病原菌。將葉柄用無(wú)菌水洗凈、晾干，在超凈臺(tái)上用75%乙醇浸潤(rùn)1 min，在病健交界處切取輕度變色維管束組織(約2 mm×2 mm)用2%NaClO液消毒2 min后，再用無(wú)菌水沖洗3次，置于濾紙上晾干，最后放在 PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)。待7 d左右長(zhǎng)出菌落后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲在PDA上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)單孢分離法獲得各分離物的純培養(yǎng)。將純化的所有菌株(菌株編號(hào)：BV1～BV5)在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后保存于4℃冰箱備用。選取典型菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、致病力測(cè)定以及分子鑒定。

1.2.2 致病性測(cè)定

采用牙簽針刺法[8]測(cè)定致病力。將直徑為6 mm的病原分離物菌餅接種在PDA培養(yǎng)基中心，再把10根經(jīng)121℃，30 min滅菌的細(xì)小牙簽(直徑1 mm，長(zhǎng)25 mm)尖端向心，呈放射狀排列在菌餅周?chē)?8℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲覆蓋牙簽尖端約10 mm時(shí)，取出帶菌牙簽，針刺接種于室內(nèi)盆栽的甜菜健株(品種新甜6號(hào))的葉柄基部。共接種5株，每株接種3個(gè)葉柄，共15個(gè)重復(fù)，并以剌入無(wú)菌牙簽的健株葉柄(5株，15葉)為對(duì)照。接種后將甜菜植株于室內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察，待發(fā)病后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并從發(fā)病葉片再次分離病原物。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 病原菌的形態(tài)

將回接證病試驗(yàn)確定其致病性的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)20 d左右，觀察并記錄菌落特征和菌體顯微形態(tài)特征，以及是否產(chǎn)生厚垣孢子、休眠菌絲及微菌核等休眠結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 病原菌rDNA-ITS、LSU、ACT片段的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

依據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)鑒定和致病力驗(yàn)證結(jié)果，將分離所得致病菌接種在PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)15 d后刮取菌絲，再用液氮將菌絲充分研磨，利用植物基因組提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH 公司，DP320-03)提取菌絲基因組DNA。

以25 μL的反應(yīng)體系在PCR儀(DL9700，北京東林昌盛生物科技有限公司)上擴(kuò)增ITS、LSU及ACT基因。反應(yīng)體系如下：2 ×rapPCR Master mix 13 μL，正向、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。ITS基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min,55℃退火1 min，72℃延伸1 min，總共37個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min；LSU基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火55 s，72℃延伸1.5 min，總共28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。ACT基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下: 94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。變黑輪枝菌的ITS、LSU及ACT序列的擴(kuò)增片段及引物。表1

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，以2 000 bp DNA Marker為參照，檢測(cè)產(chǎn)物片段大小。上海生工對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序后的序列在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中進(jìn)行序列同源性比對(duì)并提交，利用軟件MEGA5.05比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表 1 擴(kuò)增片段及其引物Table 1 Primer sequence for PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

研究表明，在中國(guó)新疆伊寧縣、察布查爾縣及昌吉市周邊的甜菜種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種與許多作物真菌性黃萎病癥狀類似的甜菜病害，該病害主要癥狀表現(xiàn)在甜菜葉部，感病后輕者葉片黃化萎蔫，植株矮縮，重者枯死，且以中脈為界半葉發(fā)病者較多，疑為甜菜真菌性黃萎病。經(jīng)田間病害高發(fā)期為7～9月，發(fā)病田可見(jiàn)大量的甜菜黃萎病病株。發(fā)病初期一般老葉先黃化，輕病株僅下部葉片黃化枯萎，重病株除心葉外全部葉片黃化枯萎(圖1A)；病葉上有明顯的沿葉脈擴(kuò)展，致脈間黃化(圖1B)，或半葉黃化枯萎(圖1C)。發(fā)病后期感病葉片邊緣向內(nèi)卷曲，萎蔫，直至整個(gè)葉片枯死。剖檢葉柄可見(jiàn)維管束略有變色，但不顯著。上述癥狀與茄子黃萎病等多種植物真菌性黃萎病癥狀相似。而在調(diào)查中未見(jiàn)植株明顯矮化，新葉短小、狹窄等癥狀[4]，該病有別于植原體黃萎病。判斷此病為真菌性黃萎病。圖1

圖1 甜菜黃萎病田間癥狀Fig.1 Sugar beet yellow wilt Symptoms on naturally infected leaf

2.2 病原菌的分離及致病性

研究表明，新疆伊寧縣、昌吉市周邊和察布查爾縣等地采集的10份病樣，約40個(gè)分離塊上以較高頻率分離到一種與輪枝菌菌落形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)相似的真菌，分離頻率約40%。并純化獲得5個(gè)典型菌株。

接種8 d后甜菜幼苗開(kāi)始顯癥，部分接種葉出現(xiàn)脈間褪綠、黃化，或局部萎蔫干枯等癥狀(圖2A)，接種發(fā)病率約12%。接種15 d后，部分接種葉片黃化、枯死(圖2B)；接種發(fā)病率約為71%；而無(wú)菌牙簽接種的幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好未出現(xiàn)發(fā)病癥狀(圖2C)。在被侵染葉片中可再次分離出與接種菌形態(tài)一致病分離物。人工牙簽針刺接種引起的發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀基本一致。圖2

注：A，B.發(fā)病甜菜植株；C.健康甜菜植株

2.3 病原菌的培養(yǎng)性狀及菌體形態(tài)特征

研究表明，菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較為緩慢，菌落初期呈白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，表面常有大小不等的白色菌絲團(tuán)，并產(chǎn)生灰白色粉末及同心輪紋，邊緣較為整齊，培養(yǎng)后期菌落逐漸變?yōu)榛液谏?，菌落背面灰黑至黑?圖3A)。菌絲體中有明顯的輪枝狀分生孢子梗，分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)無(wú)色，常有二次輪狀分枝，即分支小梗輪生于分生孢子梗上，產(chǎn)孢小梗又呈輪枝狀著生于分生小梗上，一般每輪3～4根小枝并常在枝端聚集成容易散落的孢子球(圖3B)，長(zhǎng)度為25～45 μm(30 μm avg.)。分生孢子無(wú)色透明，呈圓形或橢圓形，大小為3.7～6.8×1.8～3 μm(n=100)(圖3C)；其休眠體為厚垣孢子，卵圓形、球形或不規(guī)則形，深褐色，一般3～5個(gè)串生，直徑5.5～8.5 μm(n=100)，成熟后彼此間分散(圖3D)；不產(chǎn)生微菌核與休眠菌絲。與大麗輪枝菌有明顯區(qū)別，而與已報(bào)道的Gibellulopsisnigrescens[7]的形態(tài)描述比較一致。圖3

注：A.PDA培養(yǎng)基上的菌落；B.分生孢子梗；C.分生孢子；D.厚垣孢子 標(biāo)尺：B,C,D=20 μm

2.4 病原菌ITS、LSU及ACT序列

研究表明，對(duì)BV4菌株ITS、LSU、ACT區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物序列測(cè)定，分別獲得長(zhǎng)度為525、879和261 bp的片段。將所測(cè)菌株序列提交至GenBank，獲得序列登陸號(hào)分別為MG824977.1、MH229355.1和MN700655.1。利用該菌株序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相關(guān)序列，通過(guò)軟件MEGA5.05，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示：菌株BV4的ITS序列與G.nigrescens(MG855143.1)在同一分支，同源性為99%；LSU序列與Gibellulopsisnigrescens(MH866593.1)在同一分支，同源性為99%；ACT序列與Gibellulopsisnigrescens(JN18840.1)在同一分支，同源性為100%。

甜菜真菌性黃萎病的病原菌為變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens)，其病害為甜菜真菌性病害，可命名為甜菜黃萎病(Sugar beet Gibellulopsis yellow wilt)。圖4～圖7

圖4 基于ITS、LSU、ACT基因擴(kuò)增的電泳圖Fig 4. The PCR amplification product of ITS、LSU and ACT sequences

圖5 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on rDNA-ITS sequence

圖6 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的LSU序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on rDNA - LSU sequence

圖7 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的ACT序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on ACT sequence

3 討 論

Pethybridge[12]在1917年從馬鈴薯塊莖中分離得到一種真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)的分類方法將其歸屬于Plectosphaerellaceae科Verticillium屬，并將其命名為VerticilliumnigrescensPethybr.(中文譯名為變黑輪枝菌)。在2007年，對(duì)該菌ITS和LSU序列的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株歸屬于Plectosphaerellaceae科，Gibellulopsis屬，最終將其拉丁名定名為Gibellulopsisnigrescens[7,13]。在2011年，Inderbitzin等[14]又基于多個(gè)基因?qū)喼⒘诵碌姆诸惪蚣埽琕erticillium屬內(nèi)共包含10個(gè)種，并又將黑白輪枝菌細(xì)分為3個(gè)種，即為黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)、苜蓿輪枝菌(Verticilliumalafalfae)和非苜蓿輪枝菌(Verticilliumnonalfalfa)。G.nigrescens與Verticillium屬內(nèi)種不易區(qū)分，但各菌種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后均菌絲休眠結(jié)構(gòu)略有不同。黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)分別以暗褐色菌絲體或菌核作為休眠結(jié)構(gòu)；三體輪枝菌(Verticilliumtricorpus)可同時(shí)產(chǎn)生厚垣孢子、休眠菌絲、微菌核3種休眠體；云狀輪枝菌(Verticilliumnubilum)和變黑輪枝菌(G.nigrescens)僅可產(chǎn)生深褐色厚垣孢子，而云狀輪枝菌厚垣孢子的直徑(8.4～17.5 μm)明顯大于G.nigrescens的直徑(5.3～8.1 μm)[12,15-17]。由于G.nigrescens在形態(tài)上與輪枝菌屬內(nèi)近似種的分生孢子梗大小、輪狀分枝小梗數(shù)目、分生孢子大小上的差異不明顯，而且隨著培養(yǎng)環(huán)境的變化，一些形態(tài)特征可能不會(huì)穩(wěn)定表現(xiàn)，僅從形態(tài)上區(qū)分仍然較為困難[18]。

真菌ITS序列是介于與5.8S rRNA、18S rRNA及28S rRNA之間的區(qū)域，其序列不加入成熟核糖體，進(jìn)化速率較快且更易突變累計(jì)，其在種內(nèi)高度保守，種間差異較為明顯。屬內(nèi)種間和亞種間的分類鑒定常以ITS序列為依據(jù)[19]。近年來(lái)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在種內(nèi)鑒定中ITS的區(qū)分度不是很理想，這說(shuō)明利用單獨(dú)特定片段作為DNA條形碼具有一定的局限性。因此，結(jié)合其他序列作為輔助鑒定就顯得很有必要[20]。核糖體大亞基(LSU)序列是一段相對(duì)保守的位于25～28S的RNA序列[21]，Zare通過(guò)分析LSU序列，完成了輪枝菌屬內(nèi)種間的物種鑒定，并發(fā)現(xiàn)新的分類單元。ITS與LSU序列已逐漸成為鑒定大部分絲狀真菌的DNA條形碼[22]。ACT基因也常作為多基因聯(lián)合鑒定中的基因之一來(lái)區(qū)分輪枝菌屬內(nèi)種與G.nigrescens[14]，在菌物鑒定過(guò)程中，采用多基因位點(diǎn)來(lái)識(shí)別和鑒定已逐漸成為趨勢(shì)。因此，研究分析了變黑輪枝菌的ITS、LSU及ACT序列，也證明這3個(gè)基因可以將變黑輪枝菌與其它近似種進(jìn)行區(qū)分。其中，分離菌株的ACT基因與G.nigrescen的ACT基因的同源性高達(dá)100%，且在該序列比對(duì)結(jié)果中未出現(xiàn)輪枝菌屬相關(guān)種，因此，目前可將ACT基因作為首選片段將其近似種區(qū)分，從而達(dá)到快速鑒定的目的。

甜菜黃萎病的病原菌包括變G.nigrescens和V.dahliae，但關(guān)于甜菜來(lái)源的G.nigrescens報(bào)道甚少。多地曾報(bào)道甜菜黃萎病的發(fā)生，經(jīng)鑒定其病原菌均為V.dahliae[6,23-25]。而Zare[7]在2007年曾報(bào)道G.nigrescens可引起甜菜黃萎病，這與研究結(jié)果一致。研究從采集到的甜菜病株上未分離出V.dahliae，可能與采集的病樣數(shù)較少有關(guān)。新疆甜菜種植區(qū)分布較廣，甜菜真菌性黃萎病是否存在由V.dahliae與G.nigrescens復(fù)合侵染的情況，有待于廣泛采樣開(kāi)展進(jìn)一步研究。

20世紀(jì)70、80年代，國(guó)內(nèi)外大量報(bào)道均將植原體作為甜菜黃萎病病原，其癥狀描述也與研究觀察到的癥狀有不少相似之處，是否存在植原體、G.nigrescens、Verticillium屬內(nèi)致病種混合侵染的情況或其病原種類是否存在地域差異有待進(jìn)一步研究。

目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)甜菜來(lái)源的G.nigrescens的報(bào)道，但據(jù)已有報(bào)道，G.nigrescens寄主種類較為繁多[26]。1982年，陳吉棣[27]從馬鈴薯、菜豆、茄子、豇豆和芹菜等植物上分離出G.nigrescens；1987年，王克榮[28]從棉花黃萎病病株中分離出G.nigrescens，并發(fā)現(xiàn)其在棉花上表現(xiàn)弱致病力；2009年，段維軍[29]在寧波從進(jìn)境芹菜中分離出G.nigrescens；2010年，Hu等[30]從苜蓿分離出一株G.nigrescens。該菌寄主范圍較廣。今后宜對(duì)各寄主的危害情況及該菌在甜菜等多種作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以及針對(duì)該病害的控制方法開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

新疆甜菜真菌性黃萎病的病原菌為變黑輪枝菌，其病害可命名為甜菜黃萎病，是變黑輪枝菌在甜菜上的國(guó)內(nèi)新寄主記錄。