益生元對(duì)益生菌生長代謝的研究

王新 王利 王青云 王占東 張居典

摘 要：益生元是一種理想的人體膳食補(bǔ)充劑，可促進(jìn)益生菌的生長代謝。本試驗(yàn)從活菌數(shù)、產(chǎn)酸能力、胞外多糖產(chǎn)量和雙乙酰產(chǎn)量4個(gè)方面，研究了多種益生元，如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉對(duì)復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）發(fā)酵代謝的影響。結(jié)果表明，低聚木糖對(duì)活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力具有明顯提升作用;抗性糊精可提高益生菌胞外多糖的產(chǎn)量，并且優(yōu)于其他益生元;低聚果糖對(duì)促進(jìn)雙乙酰的生成具有明顯優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞：益生元;益生菌;生長代謝

Study on the Growth and Metabolism of Probiotics by Prebiotics

WANG Xin， WANG Li， WANG Qingyun， WANG Zhandong， ZHANG Judian

（Beidahuang Wondersun Sunshine Liquid Milk Co.， Ltd.， Harbin 150078， China）

Abstract： Prebiotics are ideal human dietary supplements that can promote the growth and metabolism of probiotics. In this experiment， a variety of prebiotics， such as fructooligosaccharides， galacto-oligosaccharides， isomaltose， xylo-oligosaccharides， Effects of polydextrose， resistant dextrin and inulin on fermentation metabolism of compound probiotics （Lactobacillus casei， Lactobacillus rhamnosus）. The results showed that xylo-oligosaccharides can significantly improve the number of viable bacteria and acid production capacity; resistant dextrin can increase the production of probiotic exopolysaccharides， and is better than other prebiotics; fructo-oligosaccharides can promote the production of diacetyl. has obvious advantages.

Keywords： prebiotics; probiotics; growth metabolism

隨著人們生活水平及健康意識(shí)的提高，益生菌及益生元越來越多的被用于酸奶發(fā)酵。益生菌是一類可定植于腸道，可改善人體微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用并且具有生物活性的微生物總稱。益生菌具有改善腸胃、防治腹瀉、增強(qiáng)人體免疫力等功效[1]。益生元不被宿主消化吸收，但可被益生菌利用發(fā)酵，從而促進(jìn)腸道益生菌的繁殖和新陳代謝，是一類可以改善宿主健康的功能物質(zhì)。目前常用的益生元是功能性低聚糖，一般由2～10個(gè)單糖分子組成，具有一定功能特性，屬于寡糖類物質(zhì)[2-3]。將益生元應(yīng)用在益生菌酸奶中，具有協(xié)同增效的作用。益生元作為益生菌的養(yǎng)料，選擇性刺激益生菌繁殖、促進(jìn)代謝，賦予益生菌在菌群中的優(yōu)勢(shì)，從而有益宿主健康[4]。本研究選取低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉6種益生元成分，選取復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）為益生菌，益生元單獨(dú)與復(fù)合益生菌組合制備益生菌酸奶，通過測(cè)定益生菌酸奶的活菌數(shù)、胞外多糖產(chǎn)量、產(chǎn)酸能力和風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰含量等指標(biāo)，為益生元在益生菌酸奶中的研究與應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚果糖;低聚半乳糖;低聚異麥芽糖;低聚木糖;聚葡萄糖;抗性糊精;菊粉;復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）;液體MRS培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

天平、pH計(jì)、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、紫外可見分光光度計(jì)、離心機(jī)、燒杯、稱量勺和溫度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

（1）液體MRS培養(yǎng)基（葡萄糖培養(yǎng)基）的制備。葡萄糖20 g、牛肉浸粉10 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、CH3COONa·3H2O 5 g、檸檬酸三銨2 g、吐溫-80 1 mL、K2HPO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、Mn-SO4·4H2O 0.05 g，定溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌20 min[5]。

（2）益生元培養(yǎng)基的制備。益生元培養(yǎng)基不添加葡萄糖，其他成分相同，葡萄糖分別用20 g/L低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉替代，添加的益生元均經(jīng)過0.22 μm水相過濾器過濾。

1.3.2 菌種活化

將冷凍保藏的0.1 g復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）凍干粉接入活化培養(yǎng)基，振蕩使菌體混合均勻，37 ℃，厭氧條件下振蕩培養(yǎng)24 h。所得菌液按體積分?jǐn)?shù)10%接入新的活化培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧條件下培養(yǎng)24 h，制得菌種母液[6]。

1.3.3 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃，厭氧培養(yǎng)48 h后測(cè)乳酸菌活菌數(shù)。乳酸菌菌落總數(shù)測(cè)定參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35—2016），分析發(fā)酵過程中益生元對(duì)益生菌促增殖能力的影響。

1.3.4 產(chǎn)酸能力測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養(yǎng)48 h后，使用pH計(jì)對(duì)酸度進(jìn)行測(cè)定，分析發(fā)酵過程中益生元對(duì)益生菌促產(chǎn)酸能力的影響。

1.3.5 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養(yǎng)48 h后，取10 mL發(fā)酵液，離心處理（4 000 r/min，15 min），取上清液，用濃度為1 mol/L的NaOH將上清液調(diào)整pH至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液（質(zhì)量濃度為3 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用），40 ℃水浴酶解2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，體積比），振搖30 min，離心（4 000 r/min，15 min），除去沉淀，重復(fù)1次。加入3～5倍體積的乙醇（體積分?jǐn)?shù)為95%），充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），離心（4 000 r/min，15 min），得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水2次，干燥得白色粉末即為多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖的質(zhì)量濃度[7-8]。

1.3.6 雙乙酰產(chǎn)量測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養(yǎng)48 h后測(cè)定樣本中的雙乙酰含量，選擇鄰苯二胺比色法測(cè)定雙乙酰含量，鄰苯二胺和雙乙酰反應(yīng)合成2，3-二甲喹喔啉，該化合物在335 nm下具有最大吸收峰[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

由表1可知，低聚木糖培養(yǎng)基中的乳酸菌活菌數(shù)含量最高，為2.2×109 CFU/g，然后依次為低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，整體看來與葡萄糖碳源比較，7種益生元均對(duì)益生菌有增殖作用。益生元可促進(jìn)益生菌繁殖，原理是菌體通過分泌相關(guān)酶作用于益生元，將其分解為基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)菌體代謝與繁殖[11]。益生菌酸奶的功能性主要取決于活菌數(shù)的多少，若要酸奶中的益生菌定植于腸道并發(fā)揮作用，攝入量是關(guān)鍵。

2.2 產(chǎn)酸能力測(cè)定

由圖1可知，低聚木糖培養(yǎng)基pH值最低為3.71，pH值由低到高依次為低聚木糖、低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，pH越低說明產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，益生元促進(jìn)益生菌的產(chǎn)酸能力與益生元促進(jìn)益生菌生長呈正相關(guān)。益生菌在益生元的作用下快速繁殖，此過程會(huì)產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，可有效降低pH值。在人體腸道中，適宜的pH值有利于維持益生菌的黏附能力，促進(jìn)其生長和定殖，腸道pH值降低可有效抑制有害菌的繁殖，促進(jìn)益生菌的繁殖[12]。

2.3 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定不同培養(yǎng)基胞外多糖產(chǎn)量，如圖2所示?？剐院囵B(yǎng)基胞外多糖產(chǎn)量最高，然后依次為聚葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖和葡萄糖。胞外多糖是乳酸菌生長代謝過程中分泌到胞外、具有獨(dú)特理化性質(zhì)和生理功能的一類高分子糖類化合物，屬于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。胞外多糖除了具有增稠、保濕、乳化和穩(wěn)定等常規(guī)理化特性外，還具有抑制癌細(xì)胞生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低膽固醇以及調(diào)節(jié)胃腸道等多種生理功能[13-14]。

2.4 雙乙酰產(chǎn)量測(cè)定

采用鄰苯二胺比色法測(cè)定不同培養(yǎng)基雙乙酰產(chǎn)量，如圖3所示。低聚果糖培養(yǎng)基雙乙酰產(chǎn)量最高，然后依次為抗性糊精、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、低聚木糖、葡萄糖和聚葡萄糖。在發(fā)酵乳制品的風(fēng)味中，雙乙酰被認(rèn)為是重要的風(fēng)味物質(zhì)，它可以賦予產(chǎn)品以獨(dú)特的芳香風(fēng)味[15]。研究雙乙酰的生成途徑、生成條件及代謝方式，有助于改善發(fā)酵乳制品的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié)論

益生菌和益生元對(duì)維持腸道運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定和人體微生態(tài)健康具有重要意義。益生菌與益生元組合使用，具有協(xié)同增效的優(yōu)勢(shì)，益生元是益生菌的養(yǎng)料，并且具有選擇刺激益生菌生長、激活益生菌代謝，賦予益生菌優(yōu)勢(shì)性能。根據(jù)上述試驗(yàn)探究得到，益生元的使用可增加益生菌單獨(dú)使用的功效，提高其活菌數(shù)以及產(chǎn)酸能力，促進(jìn)其代謝產(chǎn)物的增加。低聚木糖可有效促進(jìn)復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）的增殖，提高其產(chǎn)酸能力;抗性糊精可顯著提高胞外多糖的生成;低聚果糖對(duì)代謝過程雙乙酰的生成具有明顯作用。以上研究對(duì)產(chǎn)品開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義，對(duì)后期復(fù)合益生元的研究提供了一定基礎(chǔ)。

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