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    大白菜生物鐘突變體 lcc-1 突變表型的遺傳分析

    2022-04-01 21:28:14馬孝穎王浩任桂康張?jiān)魄?/span>李巖趙姣姣閆奕彤李昊軒杜佳寧于新冊(cè)崔維霞甄藝博盧銀馮大領(lǐng)
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:大白菜

    馬孝穎 王浩 任桂康 張?jiān)魄?李巖 趙姣姣 閆奕彤 李昊軒 杜佳寧 于新冊(cè) 崔維霞 甄藝博 盧銀 馮大領(lǐng)

    摘要:對(duì)甲基磺酸乙酯(EMS)誘變獲得的生物鐘長(zhǎng)周期突變體lcc-1、野生型WT、雜交F2群體及回交B1和B2群體進(jìn)行田間表型性狀調(diào)查,并對(duì)下胚軸長(zhǎng)度、現(xiàn)蕾時(shí)間2個(gè)突變性狀進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明,lcc-1下胚軸長(zhǎng)度、株高、開(kāi)展度、外葉長(zhǎng)、中肋長(zhǎng)度均極顯著小于WT,現(xiàn)蕾時(shí)間極顯著長(zhǎng)于WT。F2代分離群體遺傳分析結(jié)果表明,下胚軸長(zhǎng)度及現(xiàn)蕾時(shí)間性狀均符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型。結(jié)果可為調(diào)控生物鐘和現(xiàn)蕾時(shí)間關(guān)鍵基因的挖掘和基因功能深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

    關(guān)鍵詞:大白菜;生物鐘突變體;遺傳分析;下胚軸長(zhǎng)度

    中圖分類(lèi)號(hào):S634.103 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2022)05-0117-06

    收稿日期:2021-06-27

    基金項(xiàng)目:河北省高等學(xué)??茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào):BJ2019020);大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2020201)。

    作者簡(jiǎn)介:馬孝穎(1998—),女,河北張家口人,碩士研究生,主要從事園藝植物育種研究,E-mail:mxy1367234461@163.com;共同第一作者:王 浩(1991—),男,河北石家莊人,碩士研究生,主要從事植物種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種應(yīng)用研究,E-mail:1731251173@qq.com。

    通信作者:盧 銀,博士,講師,主要從事蔬菜分子染色體工程、蔬菜種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用研究,E-mail:luagzoujidong@163.com;馮大領(lǐng),博士,副教授,主要從事大白菜種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種應(yīng)用,E-mail:bjdalingfeng@163.com。

    大白菜是我國(guó)重要的葉用蔬菜,也是我國(guó)栽培面積和種植區(qū)域最廣的蔬菜作物之一,深受人們的喜愛(ài)。隨著大白菜全基因組測(cè)序的完成,其功能基因組學(xué)的研究得到快速發(fā)展,尤其是甲基磺酸乙酯(EMS)突變體庫(kù)的構(gòu)建為大白菜農(nóng)藝性狀相關(guān)優(yōu)異基因的挖掘提供了很好的研究材料。Liu等從大白菜EMS誘變?nèi)后w中獲得了一株蠟質(zhì)缺失突變體cer1[1]。劉文杰等從EMS突變體庫(kù)中篩選獲得了雄性不育、葉面刺毛突變體[2]。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員獲得了不同葉色、不同葉球、不同植株大小以及長(zhǎng)生物鐘周期等多種類(lèi)型的突變體[3-5]。

    晝夜節(jié)律鐘(circadian clock)即生物鐘,是植物生命活動(dòng)的內(nèi)在節(jié)律,可參與調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)、應(yīng)對(duì)非生物脅迫、代謝活動(dòng)等生長(zhǎng)代謝過(guò)程,增強(qiáng)植物的環(huán)境適應(yīng)性[6]。Lei等闡述了生物鐘ASSOCIATED1(CCA1)和LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)是擬南芥生物鐘的核心組成部分,影響植物對(duì)生物脅迫的響應(yīng)[7]?,F(xiàn)階段對(duì)于生物鐘突變體的表型性狀已有大量試驗(yàn)分析,前人以模式植物擬南芥為試材,探討了生物鐘突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相的轉(zhuǎn)變、光合作用和根吸收速率的變化等[8-9]。大白菜與擬南芥相比,基因組經(jīng)歷了三倍化事件,其基因功能及調(diào)控機(jī)制較模式植物擬南芥復(fù)雜的多,而大白菜的研究報(bào)道還較少。筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選到一個(gè)大白菜長(zhǎng)生物鐘周期的突變體,其表型表現(xiàn)為胚軸伸長(zhǎng),現(xiàn)蕾開(kāi)花時(shí)間延遲。哪些基因發(fā)生了突變引起表型的變化有待于進(jìn)一步研究。遺傳分析(genetic analysis)是突變體突變基因挖掘研究的重要途徑。通過(guò)調(diào)查突變體與野生型雜交、回交群體突變表型分離情況,分析突變基因的遺傳特性。Elston首次提出,主基因+多基因混合遺傳模型[10];蓋鈞鎰利用此遺傳模型建立了可同時(shí)鑒別1~3個(gè)主基因和多基因整體效應(yīng)的分析方法[11]。對(duì)表型性狀進(jìn)行遺傳分析可確定該性狀的遺傳規(guī)律。

    本研究以生物鐘長(zhǎng)周期突變體lcc-1(Long-period circadian clock-1)及野生型WT為材料,通過(guò)構(gòu)建突變體與野生型的F2代及回交群體,并對(duì)親本、F1代及群體的突變表型性狀及分離情況進(jìn)行調(diào)查,利用主基因+多基因混合遺傳模型進(jìn)行遺傳分析,該研究為探索各突變表型的遺傳規(guī)律及突變基因的深入挖掘奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    本研究以野生型WT、EMS誘變獲得的長(zhǎng)生物鐘突變體lcc-1、野生型與突變體雜交F1代、F2代、回交群體B1和B2為試驗(yàn)材料(圖1-a)。突變體lcc-1與野生型WT相比具有下胚軸長(zhǎng)(圖1-b)、延遲現(xiàn)蕾和開(kāi)花(圖1-c)、生物鐘周期延長(zhǎng)1.43 h的突變表型。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大白菜田間表型性狀調(diào)查方法

    本試驗(yàn)材料以穴盤(pán)育苗、成苗后定植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)基地,分2個(gè)時(shí)間播種調(diào)查。2018年1月16日播種,3月7日定植于露地,調(diào)查生殖生長(zhǎng)階段表型;2018年8月5日播種,9月1日定植于露地,調(diào)查營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表型。調(diào)查性狀及方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19557.5—2004《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 大白菜》并略作調(diào)整(表1)。生殖生長(zhǎng)時(shí)期調(diào)查的表型包括現(xiàn)蕾時(shí)間、薹長(zhǎng)、開(kāi)花時(shí)間;營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期調(diào)查的表型包括下胚軸長(zhǎng)度、株高、開(kāi)展度、外葉長(zhǎng)、外葉寬、外葉葉柄長(zhǎng)。

    1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

    使用Microsoft Excel軟件和IBM SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)lcc-1的9個(gè)表型進(jìn)行分析,設(shè)置3個(gè)重復(fù),計(jì)算平均值,并進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)。

    依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法整理春季4世代P1、P2、F1、F2和秋季6世代P1、P2、F1、F2、B1、B2各群體表型數(shù)據(jù),參照蓋鈞鎰鑒別1~3個(gè)主基因和多基因整體效應(yīng)的分析方法[11-12],使用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物數(shù)量性狀分離分析軟件包SEA,對(duì)本試驗(yàn)擬分析的3個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行主基因-多基因模型的多世代聯(lián)合分析,得到這3個(gè)數(shù)量性狀的遺傳模型以及與之相對(duì)應(yīng)的AIC值,對(duì)備選模型進(jìn)行一組(U21、U22、U23、nW2、Dn)適合性檢驗(yàn),選擇統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平個(gè)數(shù)較少的模型作為最優(yōu)模型,計(jì)算出遺傳率。調(diào)查F2分離群體中現(xiàn)蕾時(shí)間突變型與野生型的植株數(shù),再根據(jù)卡方檢測(cè)方法,測(cè)定其結(jié)果,確定分離比例,進(jìn)而推導(dǎo)出相應(yīng)基因的遺傳規(guī)律。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 野生型WT與突變體lcc-1的表型特征差異

    由圖2可知,WT下胚軸平均長(zhǎng)度為2.22 cm,lcc-1下胚軸平均長(zhǎng)度為3.91 cm,lcc-1下胚軸極顯著長(zhǎng)于WT(P<0.01)。

    由圖3可知,WT平均株高49.08 cm,lcc-1平均株高30.46 cm,WT平均開(kāi)展度78.59 cm,lcc-1平均開(kāi)展度53.10 cm,WT平均外葉長(zhǎng)37.04 cm,lcc-1平均外葉長(zhǎng)24.50 cm,WT平均中肋長(zhǎng)度22.90 cm,lcc-1平均中肋長(zhǎng)度15.10 cm,以上表型lcc-1均較WT明顯減小,差異達(dá)極顯著水平;WT平均現(xiàn)蕾時(shí)間75.0 d,lcc-1平均現(xiàn)蕾時(shí)間77.1 d,WT平均開(kāi)花時(shí)間93.4 d,lcc-1平均開(kāi)花時(shí)間98.15 d,以上表型lcc-1均較WT明顯增加,差異達(dá)極顯著水平;WT薹長(zhǎng)48.6 cm,lcc-1薹長(zhǎng)23.22 cm,WT葉片寬 23.88 cm,lcc-1葉片寬16.33 cm,以上表型lcc-1均較WT明顯減少,差異達(dá)顯著水平。從株高、開(kāi)展度、外葉長(zhǎng)、外葉寬、中肋長(zhǎng)度和薹長(zhǎng)的數(shù)據(jù)看,lcc-1植株顯著或極顯著小于WT。從自然春化條件下的現(xiàn)蕾時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間看,lcc-1現(xiàn)蕾和開(kāi)花時(shí)間極顯著長(zhǎng)于WT。

    2.2 突變體lcc-1下胚軸長(zhǎng)度的遺傳分析

    lcc-1下胚軸平均長(zhǎng)度為3.91 cm,WT下胚軸平均長(zhǎng)度為2.22 cm,WT平均下胚軸長(zhǎng)度僅為lcc-1的56.78%,t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明,2個(gè)親本的下胚軸長(zhǎng)度存在極顯著差異,F(xiàn)1平均下胚軸長(zhǎng)度為 2.68 cm,偏向于短下胚軸WT。F2、B1、B2的下胚軸長(zhǎng)度均呈現(xiàn)偏正態(tài)分布(圖4-a、圖4-b、圖4-c)。

    用植物數(shù)量性狀主基因+多基因遺傳模型的多世代聯(lián)合分析方法對(duì)6個(gè)世代群體下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行聯(lián)合分析,分別計(jì)算6個(gè)世代群體在24種遺傳模型下的極大似然函數(shù)值(MLV)和AIC值。根據(jù)AIC準(zhǔn)則,在備選遺傳模型中,AIC最小者為最優(yōu)模型。由表2可知,AIC值較低的是2MG-ADI(2對(duì)加性-顯性-上位性主基因模型)、PG-ADI(加性-顯性-上位性多基因模型)、MX1-AD-ADI (1對(duì)加性-顯性主基因+加性-顯性多基因模型)、MX2-ADI-ADI(2對(duì)加性-顯性-上位性主基因和加性-顯性-上位性多基因模型)、MX2-ADI-AD(2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型),共5個(gè)模型,其AIC值分別為432.277 2、405.791 6、408.246 5、419.434 3、420225 0。

    適合性檢驗(yàn)結(jié)果(表3)表明,5個(gè)模型均符合,但MX2-ADI-AD模型適合性檢驗(yàn)效果最佳,且AIC值較小。因此,可確定 MX2-ADI-AD(2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型)為大白菜下胚軸長(zhǎng)度的最佳遺傳模型。

    由表4可知,MX2-ADI-AD模型中2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值均為-0.063 4,顯性效應(yīng)分別為-0.093 6和-0.282 8,顯性效應(yīng)值大于加性效應(yīng)值,說(shuō)明2對(duì)主基因遺傳以顯性效應(yīng)為主。在B1、B2、F2群體中,主基因的遺傳率各不相同。在F2群體中,主基因遺傳率最高,為73.073 9%。在B1群體中主基因遺傳率為42.565 6%,低于50%。在B2群體中主基因遺傳率為59.640 1%。B1、B2、F2多基因的遺傳率分別為39.191 2%、13.793 0%、11.643 8%,主基因遺傳率均大于多基因遺傳率:環(huán)境因素引起的遺傳變異較小。

    2.3 突變體lcc-1現(xiàn)蕾時(shí)間的遺傳分析

    lcc-1現(xiàn)蕾時(shí)間平均值為77.1 d,WT現(xiàn)蕾時(shí)間平均值為75.0 d,lcc-1現(xiàn)蕾時(shí)間比WT晚2.1 d。對(duì)2個(gè)親本的現(xiàn)蕾時(shí)間平均值進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)后可知,2個(gè)親本間的現(xiàn)蕾時(shí)間差異達(dá)到極顯著水平,說(shuō)明親本間存在顯著的遺傳差異。F1代現(xiàn)蕾時(shí)間平均值為75.75 d,偏向于WT。由F2現(xiàn)蕾時(shí)間的次數(shù)分布(圖5)可知,F(xiàn)2世代現(xiàn)蕾時(shí)間的分布偏正態(tài)分布。

    用植物數(shù)量性狀主基因+多基因遺傳模型的多世代聯(lián)合分析方法對(duì)4個(gè)世代群體開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行聯(lián)合分析,分別計(jì)算4個(gè)世代群體在24種遺傳模型下的MLV和AIC值。根據(jù)AIC準(zhǔn)則,在備選遺傳模型中,AIC最小者為最優(yōu)模型。由表5可知,AIC值較低的是MX2-ADI-AD、MX2-ADI-ADI 這2個(gè)模型,其AIC值分別為768.832 5、774.832 5。故初步確定這2個(gè)模型為4世代群體現(xiàn)蕾時(shí)間遺傳的候選模型。

    適合性檢驗(yàn)結(jié)果(表6)表明,5個(gè)模型均通過(guò)適合性測(cè)驗(yàn),但MX2-ADI-AD適合性檢驗(yàn)效果最佳,且AIC值和MLV均較小。因此,綜合以上分析,確定MX2-ADI-AD(2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型)為調(diào)控大白菜突變體現(xiàn)蕾時(shí)間的最佳遺傳模型。

    由表7可知,MX2-ADI-AD模型下的遺傳參數(shù),現(xiàn)蕾時(shí)間是由2對(duì)主基因+多基因控制的,且第1個(gè)主基因具有負(fù)向的加性效應(yīng),在F2群體中主基因遺傳率是96.109 1%,多基因遺傳率未檢測(cè)出,說(shuō)明F2群體中現(xiàn)蕾時(shí)間以主基因遺傳為主。

    3 結(jié)論與討論

    篩選獲得,該方法以獲得SNP單堿基突變?yōu)橹鳎瑹o(wú)大片段DNA變異,而調(diào)查結(jié)果表明,lcc-1突變體卻同時(shí)具有生物鐘周期變長(zhǎng)、下胚軸變長(zhǎng)、晚花等多個(gè)不同突變表型,且相關(guān)性狀均存在顯著差異。因此,可能存在一因多效和多基因突變2種情況。在已有研究中,生物鐘變化導(dǎo)致植物下胚軸長(zhǎng)度、開(kāi)花時(shí)間和植株大小的改變均有報(bào)道。前人研究發(fā)現(xiàn),擬南芥隱花色素CRY2蛋白大量積累可獲得早花突變體,在低強(qiáng)度藍(lán)光下下胚軸明顯伸長(zhǎng)[13];TCP2藍(lán)光依賴性地抑制擬南芥下胚軸的伸長(zhǎng),其功能缺失突變體具有晚花的表型[14];GmPHYB1過(guò)表達(dá)使擬南芥株型矮化緊湊,在短日條件下提前開(kāi)花并強(qiáng)烈抑制下胚軸的伸長(zhǎng)[15];GI和CO基因受生物鐘調(diào)控,在長(zhǎng)日照條件下,GI和CO基因會(huì)促進(jìn)擬南芥開(kāi)花[16]。擬南芥ZEITLUPE(ZTL) 家族成員的突變會(huì)影響晝夜節(jié)律和開(kāi)花時(shí)間[17]。本研究中對(duì)下胚軸長(zhǎng)度和現(xiàn)蕾時(shí)間2個(gè)突變性狀的遺傳分析結(jié)果均符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因的遺傳模型,可推測(cè)這些性狀可能由調(diào)控生物鐘相關(guān)基因的突變引起,但須要進(jìn)一步借助Mutmap、重測(cè)序、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段深入挖掘研究。

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