農(nóng)作物中Cry1A(c)和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立

羅建興 劉國強(qiáng) 其勒木格 郭梁

摘要：采用羧基熒光素（FAM）和六氯熒光素（HEX）熒光基團(tuán)標(biāo)記探針，建立針對(duì)農(nóng)作物中常見抗蟲和抗除草劑基因的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，通過特異性、檢出限以及模擬摻假試驗(yàn)驗(yàn)證此方法在轉(zhuǎn)基因檢測中的適用性。特異性檢測試驗(yàn)中僅轉(zhuǎn)基因作物（轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因大豆）和陽性質(zhì)粒檢測出相應(yīng)轉(zhuǎn)基因成分，其余樣品均未出現(xiàn)明顯PCR擴(kuò)增曲線;檢出限結(jié)果表明，雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因的檢出限分別為1、0.1 ng，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線r2值均大于0.98，具有對(duì)農(nóng)作物中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量檢測的能力;模擬摻假檢測顯示此方法可檢測到1%的Cry1A（c）和5%的CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分。綜上所述，本試驗(yàn)建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法適用于對(duì)Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測和定量分析。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因;Cry1A（c）基因;CP4-EPSPS基因;雙重實(shí)時(shí)熒光PCR;特異性;檢出限;模擬摻假

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0023-05

收稿日期：2021-04-16

基金項(xiàng)目：錫林郭勒職業(yè)學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號(hào)：ZD-2020-04、ZD-2019-01）。

作者簡介：羅建興（1993—），男，陜西榆林人，主要從事食品安全檢測和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及轉(zhuǎn)基因成分檢測研究。E-mail：ljxylyh@126.com。

通信作者：郭 梁，博士，主要從事轉(zhuǎn)基因成分檢測和動(dòng)物源性成分檢測以及微生物資源開發(fā)研究。E-mail：herdman86@163.com。

轉(zhuǎn)基因是指利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將一些有利于人類生產(chǎn)生活的外源基因?qū)雱?dòng)物、植物或微生物中，通過對(duì)生物體內(nèi)DNA分子修飾改造達(dá)到改變?cè)锓N遺傳性狀的目的，從而使原物種獲得本不具備的優(yōu)良品質(zhì)和特性[1-2]。1996年轉(zhuǎn)基因煙草的商業(yè)化種植，標(biāo)志著全球轉(zhuǎn)基因商業(yè)化時(shí)代正式到來[3]。由于轉(zhuǎn)基因具有提高產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)、抗蟲、抗氧化劑、抗逆、性狀優(yōu)良等特性，全球都加大了對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的種植[4-6]。有研究表明，截至2018年年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)到1917億hm2[7]。據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)預(yù)計(jì)，2020年轉(zhuǎn)基因食品帶來的生物經(jīng)濟(jì)將直接達(dá)15萬億美元，從而成為保持經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的中堅(jiān)力量[8]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物上的廣泛應(yīng)用不僅帶動(dòng)了全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展，同時(shí)也產(chǎn)生了巨大社會(huì)效益，但任何技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步都離不開風(fēng)險(xiǎn)管理。目前，一些人認(rèn)為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品在營養(yǎng)成分、毒理性、潛在致敏性等多方面存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)對(duì)環(huán)境及人類健康產(chǎn)生巨大影響[9-11]。20世紀(jì)90年代有研究表明，斑蝶幼蟲在食用轉(zhuǎn)基因馬利筋草后，產(chǎn)生了40%以上的死亡率[12]。同時(shí)代的英國研究者給大鼠投食轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，最終導(dǎo)致大鼠免疫系統(tǒng)受損，身體發(fā)育出現(xiàn)異常[11]。此類事件的發(fā)生間接推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展，目前針對(duì)轉(zhuǎn)基因的檢測技術(shù)主要分為3個(gè)方面，即基于核酸、蛋白[13]及小分子代謝物[14]的檢測。由于核酸本身的穩(wěn)定性相比蛋白和小分子代謝物較強(qiáng)，在各種產(chǎn)品加工過程中穩(wěn)定、不易降解，同時(shí)制備過程簡單、成本低[15-16]。因此，目前的檢測技術(shù)尤以基于核酸檢測居多，核酸檢測應(yīng)用較為廣泛的主要是PCR技術(shù)。傳統(tǒng)PCR只能對(duì)單一基因進(jìn)行檢測，在一定程度上具有檢測通量低的缺陷，而多重PCR雖具有擴(kuò)增多重靶標(biāo)的特點(diǎn)，但在后續(xù)電泳檢測試驗(yàn)中卻很難對(duì)一些大小相近的DNA片段進(jìn)行區(qū)分[17]。而熒光定量PCR由于特異性強(qiáng)、靈敏度高、無交叉污染且高通量的特點(diǎn)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測的有效主流技術(shù)[3]。

Cry1A（c）和CP4-EPSPS分別是轉(zhuǎn)基因植物中常見的抗蟲和抗除草劑基因[18]，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中對(duì)農(nóng)作物的優(yōu)良品質(zhì)和高產(chǎn)等起著非常重要的作用。其中，Cry1A（c）是蘇云金芽孢桿菌的一種殺蟲晶體蛋白，自然界的一些敏感幼蟲在吞食附帶有該蛋白的農(nóng)作物后會(huì)形成活性毒素，最終導(dǎo)致昆蟲因滲透壓失衡死亡，該轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)林衛(wèi)生害蟲防治[19]。CP4-EPSPS是一種抗除草劑草甘膦基因，能夠消除田間雜草，降低人工成本[20]，目前沒有Cry1A（c）和CP4-EPSPS同步檢測的研究和應(yīng)用。因此，本試驗(yàn)通過建立雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法對(duì)植物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測，以期為轉(zhuǎn)基因食品安全檢測提供高效的檢測手段和方法，從而保證食品的安全性和民眾知情權(quán)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3種轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)樣品（轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因水稻）由從事轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)室提供;8種普通非轉(zhuǎn)基因作物（棉花、水稻、大豆、玉米、小麥、苜蓿、白菜及煙草）于錫林浩特市本地農(nóng)貿(mào)市場及超市采購。

TransStart Probe qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;qPCR引物和探針委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成;DNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

高速臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)為5418R），德國艾本德股份公司（Eppendorf AG公司）;核酸蛋白測定儀（型號(hào)為Nanodrop 2000c），美國Thermo Fisher Scientific;實(shí)時(shí)熒光PCR儀（型號(hào)為7300Plus），美國ABI公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 參考GB/T 19495.4—2018[21]用熒光基團(tuán)FAM和HEX分別標(biāo)記Cry1A（c）和CP4-EPSPS探針并委托北京睿博興科公司合成引物和探針，2種基因引物與探針序列見表1。

1.2.2 試驗(yàn)樣品基因組DNA的提取與純化 采用溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取DNA，并加適量的滅菌雙蒸水溶解樣品DNA。經(jīng)核酸蛋白分析儀測定濃度后，將試驗(yàn)樣品DNA終濃度稀釋至約100 ng/μL，且使D260 nm/D280 nm為1.8～2.0，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 陽性質(zhì)粒DNA的提取 本實(shí)驗(yàn)室具有事先經(jīng)過驗(yàn)證且特異性及可靠性檢測結(jié)果均良好的陽性質(zhì)粒pCry1A（c）和pCP4-EPSPS，能夠在試驗(yàn)中起到陽性對(duì)照的作用，按DNA提取試劑盒所述步驟提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定濃度后，將其終濃度稀釋為0.5 ng/μL，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及條件 反應(yīng)體系（總體系20 μL）：上下游引物各1 μL，探針1 μL，模板DNA1 μL，TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)退火時(shí)采集熒光信號(hào)。

1.2.5 特異性檢測試驗(yàn) 以“1.1”節(jié)所示試驗(yàn)樣品的DNA及“1.2.3”節(jié)提取的2種轉(zhuǎn)基因陽性質(zhì)粒DNA為模板，按照上述PCR反應(yīng)體系加樣，對(duì)設(shè)計(jì)和合成引物及探針進(jìn)行特異性檢測試驗(yàn)。根據(jù)典型擴(kuò)增曲線和各反應(yīng)體系循環(huán)閾值的差異驗(yàn)證Cry1A（c）和CP4-EPSPS這2種基因引物和探針對(duì)于不同樣品DNA模板的特異性。

1.2.6 檢出限檢測試驗(yàn)及定量分析 將質(zhì)量濃度同為10 ng/μL的轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆等體積混合，加滅菌雙蒸水對(duì)混合DNA原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，使各梯度DNA模板質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL，然后按照反應(yīng)體系加樣進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過反應(yīng)測定試驗(yàn)的檢出限。根據(jù)檢出限分析結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)DNA樣品中的轉(zhuǎn)基因成分作定量分析。

1.2.7 模擬摻假檢測試驗(yàn) 將同濃度轉(zhuǎn)基因作物DNA與其非轉(zhuǎn)基因作物DNA（轉(zhuǎn)基因棉花+普通非轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆+普通非轉(zhuǎn)基因大豆）按不同體積進(jìn)行混合，使轉(zhuǎn)基因作物成分百分含量分別為0.1%、1%、5%、10%，然后按照實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序進(jìn)行模擬摻假試驗(yàn)檢測，以檢驗(yàn)引物和探針在轉(zhuǎn)基因作物摻假檢測試驗(yàn)中的適用性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過試驗(yàn)儀器自帶軟件處理和分析檢測結(jié)果，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測

利用雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)Cry1A（c）和CP4-EPSPS基因引物和探針進(jìn)行特異性檢測，檢測結(jié)果如表2和圖1所示?？梢钥闯觯D(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因水稻中均檢測出Cry1A（c）基因，轉(zhuǎn)基因大豆中檢測出CP4-EPSPS基因，在混合陽性質(zhì)粒中2種基因均有檢出，以上試驗(yàn)結(jié)果循環(huán)數(shù)（CT值）的標(biāo)準(zhǔn)差均在0.1～1之間，且擴(kuò)增曲線具有很好的平行度（每個(gè)樣品3個(gè)平行反應(yīng)），說明試驗(yàn)檢測結(jié)果較好，而對(duì)于其他樣品的檢測無明顯特異性擴(kuò)增曲線，進(jìn)一步說明設(shè)計(jì)引物及探針對(duì)于不同檢測樣品的特異性。

2.2 檢出限檢測與定量分析

特異性檢測試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆中分別含有Cry1A（c）和CP4-EPSPS基因，將上述2種樣品DNA進(jìn)行同濃度等體積混合，并進(jìn)行梯度稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1、0.01、0001、0.000 1、0.000 01 ng/μL的樣品，以不同濃度樣品DNA為模板（每個(gè)濃度樣品6個(gè)平行反應(yīng)），通過雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測以測定引物和探針的檢出限，相應(yīng)的CT檢測結(jié)果如表3所示，擴(kuò)增曲線見圖2，以擴(kuò)增結(jié)果CT≤35次時(shí)判定為確認(rèn)檢出?？梢钥闯?，Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因在混合DNA中的檢出限分別為1、0.1 ng，試驗(yàn)使用△CT法進(jìn)行相對(duì)定量，檢出限試驗(yàn)結(jié)果顯示DNA濃度的對(duì)數(shù)值與其對(duì)應(yīng)的CT值呈線性關(guān)系，然后以模板DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸、CT值為縱軸得到回歸方程，結(jié)果見圖3。既得2種基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：Cry1A（c），y=-3.682x+53.86，r2=0983 6;CP4-EPSPS，y=-2.616x+47.69，r2=0.987 2。由于雙重?cái)U(kuò)增2個(gè)基因的r2顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈明顯線性相關(guān)，說明該方法可適用于轉(zhuǎn)基因作物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS這2種基因的雙重檢測。

2.3 模擬摻假檢測

試驗(yàn)將同濃度轉(zhuǎn)基因作物DNA與非轉(zhuǎn)基因作物DNA按一定比例混合來模擬摻假檢測，摻假組合為轉(zhuǎn)基因棉花+非轉(zhuǎn)基因棉花（組合1）、轉(zhuǎn)基因大豆+非轉(zhuǎn)基因大豆（組合2），按比例混合使混DNA中轉(zhuǎn)基因成分含量為0.1%、1%、5%、10%，利用雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表4。以擴(kuò)增結(jié)果CT≤35次時(shí)判定為確認(rèn)檢出，由此可知，組合1中針對(duì)Cry1A（c）基因的檢測在摻假試驗(yàn)中能夠檢測到1%的轉(zhuǎn)基因棉花成分，針對(duì)CP4-EPSPS基因的檢測因組合1樣品中不含有該轉(zhuǎn)基因成分，因此未檢測到（圖4）。綜上所述，本試驗(yàn)建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法適用于對(duì)摻假樣品中的轉(zhuǎn)基因成分檢測。同理，組合2中針對(duì)CP4-EPSPS基因的檢測在試驗(yàn)中能夠檢測到5%的轉(zhuǎn)基因大豆成分，相較組合1，其檢測結(jié)果較差。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在特異性檢測過程中以水作為空白對(duì)照，并且增加了提取空白的特異性檢測，進(jìn)一步加強(qiáng)了試驗(yàn)檢測的完整性，在對(duì)試驗(yàn)材料的檢測中，僅在陽性質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因作物檢出轉(zhuǎn)基因成分，其他普通非轉(zhuǎn)基因樣品中并未檢出轉(zhuǎn)基因外源基因，說明試驗(yàn)引物和探針具有較好的特異性，能夠滿足對(duì)轉(zhuǎn)基因定性檢測。對(duì)樣品原液梯度稀釋進(jìn)行檢出限檢測，結(jié)果表明，Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因在混合DNA中的檢出限分別為1、0.1 ng，以CT值為縱軸、模板DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程r2均大于0.98，說明檢測結(jié)果能夠較好地對(duì)外源轉(zhuǎn)基因進(jìn)行定量分析。模擬摻假在一定程度能夠?qū)z測方法或技術(shù)的適用性進(jìn)行評(píng)估和檢驗(yàn)，本試驗(yàn)顯示，雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測分別為1%[Cry1A（c）]和5%（CP4-EPSPS），一定程度上能滿足實(shí)際檢測需求。

2017年的國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）數(shù)據(jù)顯示，1996—2016年20年間轉(zhuǎn)基因共使農(nóng)作物增產(chǎn)6.576億t[22]，全球轉(zhuǎn)基因種植面積的逐年增加使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在市場上的份額也越來越大，這都給轉(zhuǎn)基因檢測帶來了巨大的挑戰(zhàn)。同時(shí)，由于基因元件的復(fù)雜性和轉(zhuǎn)基因作物的多樣性加大了轉(zhuǎn)基因檢測的難度和需求。2009年，吳珊等對(duì)大豆產(chǎn)品外源基因做了普通PCR、熒光定量PCR及微流控芯片等3種方法的靈敏度檢測比較，結(jié)果顯示，普通PCR對(duì)于個(gè)別基因存在無法檢測到或凝膠條帶較弱的情況，根據(jù)普通PCR和凝膠檢測結(jié)果容易造成假陰性。熒光PCR和微流體芯片技術(shù)檢測則不存在此類問題，且檢測結(jié)果更好，靈敏度和檢測效率也更高[23]。王穎等也對(duì)普通PCR和熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了比較[24]，得出了相同的結(jié)論。尹全等利用多重PCR對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行篩查檢測，通過構(gòu)建的基因元件信息矩陣表得出，必須檢測2個(gè)或2個(gè)以上基因才能夠?qū)ν晃锓N不同品系的轉(zhuǎn)基因作物達(dá)到檢測的目的[25]。相比常規(guī)PCR技術(shù)，多重PCR可以對(duì)多個(gè)靶基因片段進(jìn)行檢測，不僅打破常規(guī)PCR因引物受限只能檢測1個(gè)目的片段的局限，還大幅提高了檢測的效率，能夠較好地滿足對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)基因品種的檢測需求。本試驗(yàn)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)農(nóng)作物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，相比于多重PCR不僅檢測準(zhǔn)確性、靈敏度更高且能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量。

參考文獻(xiàn)：

[1]顧愛國，王 偉，張曉強(qiáng)，等. 轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（3）：180-183.

[2]勵(lì)建榮.轉(zhuǎn)基因食品的優(yōu)點(diǎn)和安全性[J]. 食品工業(yè)科技，2002，23（4）：71-73.

[3]趙雨佳，范培蕾，梁 亮，等. 轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展與檢測分析[J]. 計(jì)量技術(shù)，2019（10）：54-57.

[4]Luthy J. Detection strategies for food authenticity and genetically modified foods[J]. Food Control，1999，10（6）：359-361.

[5]樊振江，孟 楠.轉(zhuǎn)基因食品的安全性及優(yōu)點(diǎn)[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2017（3）：35-36.

[6]沈 泓，李 超，李 玨.分子生物學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)信息，2017（15）：57-59，61.

[7]國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織. 2018年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J]中國生物工程雜志，2019，39（8）：1-6.

[8]張振鐸.轉(zhuǎn)基因食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)的發(fā)展研究[J]. 現(xiàn)代食品，2019（24）：135-137，148.

[9]宋 歡，王坤立，許文濤，等. 轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2014，35（15）：295-303.

[10]王立平，王 東，龔熠欣，等. 國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品食用安全性研究進(jìn)展與生產(chǎn)現(xiàn)狀[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2018，20（3）：94-103.

[11]賈士榮，金蕪軍.國際轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論：幾個(gè)事件的剖析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11（1）：1-5.

[12]Losey J E，Rayor L S，Carter M E.Transgenic pollen harms monarch larvae[J]. Nature，1999，399（6733）：214.

[13]李夏瑩，高鴻飛，劉鵬程，等. 轉(zhuǎn)基因作物快速檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（3）：5-9.

[14]梁晉剛，徐俊鋒，焦 悅，等. 轉(zhuǎn)基因作物快速檢測技術(shù)進(jìn)展與展望[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（21）：71-74.

[15]羅建興，海 小，劉國強(qiáng)，等. 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測食品中鵪鶉源性成分[J]. 食品研究與開發(fā)，2019，40（3）：177-183.

[16]楊鎮(zhèn)州，劉 剛，梁 文. 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788芯片式數(shù)字PCR定量方法的建立[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（5）：68-73.

[17]李永進(jìn)，熊 濤，吳華偉，等. 利用可視化膜芯片檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（11）：2926-2929.

[18]劉國強(qiáng)，海 小，羅建興，等. 基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測植物中轉(zhuǎn)基因成分[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2020，40（10）：4-9.

[19]吳洪福，郭淑元，李海濤，等. 蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（2）：118-122.

[20]郭文芳，王 楠，李剛強(qiáng)，等. CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因棉花植株鑒定方法比較分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（4）：114-118.

[21]轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法：GB/T 19495.4—2018[S].

[22]James C. Global status of commercialized Biotech/GM crops in 2017[J]. ISAAA Briefs，2017（35）：53.

[23]吳 姍，吳志毅，張曉峰，等. 普通PCR法、熒光定量PCR法及微流控芯片法檢測大豆產(chǎn)品中外源基因靈敏度的比較[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2009，9（2）：176-186.

[24]王 穎，任志瑩，陳芳芳.應(yīng)用普通PCR與實(shí)時(shí)熒光標(biāo)記PCR技術(shù)檢測玉米子粒中轉(zhuǎn)基因成分的比較[J]. 玉米科學(xué)，2016，24（5）：43-48.

[25]尹 全，李 憶，宋 君，等. 多重PCR篩查檢測進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，30（6）：1045-1053.