模擬體內(nèi)環(huán)境下血栓形成及藥物溶栓作用

任莉莉 張勝海 程昆木 楊凌鑒 黃九林

摘 要：研究應(yīng)用芯片灌注模型成功模擬體內(nèi)環(huán)境分析不同管徑對(duì)血栓形成和溶解的影響，并通過熒光顯微鏡實(shí)時(shí)檢測(cè)了溶栓藥物對(duì)血栓溶解的作用。通過對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)血栓容易在細(xì)小管道內(nèi)生成，且溶栓所需時(shí)間較長(zhǎng)。兩種不同溶栓藥物納豆激酶（NK）和蚓激酶（LK）對(duì)血栓的溶解情況有明顯不同，在相同管徑和流速條件下，NK和LK質(zhì)量濃度均為2.5 mg/mL時(shí)溶解血栓時(shí)間分別為21、12 min;高質(zhì)量濃度藥物溶解血栓速度更快，且LK作用效果比NK較為顯著。通過熒光標(biāo)記，LK可同時(shí)減少纖維蛋白原和纖維蛋白，從而高效溶解血栓。

關(guān)鍵詞：納豆激酶;蚓激酶;微流控芯片;血栓形成;血栓溶解

中圖分類號(hào)：R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1001-5922（2022）02-0001-05

血栓栓塞性疾?。═hromboembolic disease，TD）涉及心血管、腎臟科、神經(jīng)內(nèi)科、外科、骨科、腫瘤等多個(gè)領(lǐng)域，在很多方面影響著人體健康。纖維蛋白聚合成網(wǎng)狀后和血小板一起形成能夠止血的凝塊，同時(shí)也可以生成病理性血管栓塞[1]。體內(nèi)纖維蛋白凝固和溶解系統(tǒng)是互相協(xié)調(diào)的，用來保持血栓形成和溶解之間的平衡。一旦平衡打破，病理狀況就會(huì)發(fā)生。纖維蛋白原是纖維蛋白的前體物質(zhì)，由兩個(gè)相同亞單位組成，包含3個(gè)多肽鏈。在凝血酶的作用下，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，再通過聚合作用形成纖維蛋白凝塊。從而引起心肌梗塞、血管栓塞等疾病。纖維蛋白原的活化也與炎癥、腫瘤生長(zhǎng)和其他疾病有關(guān)[2-3]。

降解纖維蛋白是一個(gè)重要的治療血管栓塞性疾病的方法。纖維蛋白溶酶可以直接水解纖維蛋白。其中納豆激酶（Nattokinase，NK）是從傳統(tǒng)食品納豆、豆豉中提取出來的，有纖溶酶原激活作用，也可以直接溶解纖維蛋白。納豆激酶的纖維蛋白溶解活性可以在血液中持續(xù)3 h[4-5]。蚓激酶（Lumbrukinase，LK）是從蚯蚓中提取的一種絲氨酸蛋白酶，具有很強(qiáng)的溶解纖維蛋白和血栓的能力[6-7]。這兩種酶來源豐富、安全有效，是很有潛力的溶栓藥物。很多體外血栓形成和溶解實(shí)驗(yàn)是在封閉的攪拌條件、培養(yǎng)皿或修飾的流動(dòng)小室進(jìn)行的[1，8-9]。為了更好地建立一個(gè)體外研究血栓栓塞性疾病的模型，本研究用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制備微流控芯片，膠原蛋白修飾管道，模擬人體內(nèi)微動(dòng)脈血管[10-12]，用少量的血樣和凝血酶在芯片管道內(nèi)形成血栓。在流動(dòng)條件下，用熒光顯微鏡觀察血栓在不同管道形成情況及其在NK和LK作用下的溶解過程，為體外研究血栓栓塞性疾病的治療提供更為有效的方法。

1 結(jié)果與討論

1.1 血栓形成分析

本研究制備了不同管徑的微流控芯片反應(yīng)區(qū)（見圖1），模擬不同直徑血管，芯片管徑高均為35 μm，寬分別為300、200和100 μm。其中一個(gè)操作區(qū)示意圖放大后可以看到兩個(gè)入口處分別加入血漿和凝血酶，溶解血栓時(shí)為溶栓藥物的進(jìn)口;波浪處有助于溶液充分混合;可利用顯微鏡在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行觀察;剩余反應(yīng)液由出口流出。進(jìn)口和出口處連接帶有醫(yī)用級(jí)聚乙烯管的不銹鋼管，連接注射泵進(jìn)行液體的灌注。

連續(xù)注射血漿和凝血酶（10 min）形成血栓，各個(gè)管徑內(nèi)血栓的生成情況如圖2所示。在灌注過程中，凝血酶激活纖維蛋白原發(fā)生凝集反應(yīng)，血小板聚集，纖維狀物質(zhì)出現(xiàn)。隨著持續(xù)的注射血漿和凝血酶，上述過程不斷循環(huán)，血栓變的更多更大。在同樣的注射條件下，100 μm的管道內(nèi)液體流動(dòng)受到的阻力相對(duì)較大，當(dāng)一處有纖維蛋白覆蓋時(shí)，凝塊很容易快速生長(zhǎng)，堵塞管道（見圖2（a）示），且這樣的部位有多處。300 μm的管徑中液體流動(dòng)受到的阻力較小，沒有大的血栓生成，形成的血栓小而松散（見圖2（c）示）。200 μm管徑內(nèi)的血栓形成情況介于前兩者之間（圖2（b）示）。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，血栓容易在細(xì)小管道內(nèi)生成，即血栓栓塞易發(fā)生在微血管中。該方法模擬血管內(nèi)血栓形成的可行性較好。

1.2 血栓溶解結(jié)果

1.2.1 不同管徑對(duì)血栓溶解的影響

當(dāng)向不同管徑的芯片中以1.5 μL/min的流速注入溶栓藥物NK和LK（1.5 mg/mL）時(shí)，從表1可以看出，隨著芯片管徑的增大，血栓溶解需要的時(shí)間越少;不同管徑內(nèi)血栓溶解情況基本一致，LK的溶栓時(shí)間均少于NK，且LK溶栓效果優(yōu)于NK;100 μm管徑中的血栓溶解時(shí)間最長(zhǎng)。在同樣的注射條件下，100 μm的管道內(nèi)血栓較多且密度較大，有的地方甚至被堵塞，藥物流動(dòng)時(shí)受到的阻力較大，溶解時(shí)也需要較長(zhǎng)的時(shí)間。300 μm的管徑中血栓小而松散，液體受到的阻力較小，溶解時(shí)所需時(shí)間較少。200 μm管徑內(nèi)的血栓溶解情況則介于前兩者之間。結(jié)合不同管徑血栓形成情況，以200 μm管徑模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度藥物對(duì)血栓溶解的影響

溶栓酶的濃度越高，血栓溶解需要的時(shí)間越少;同一濃度下，血栓在藥物作用下隨著時(shí)間的增加逐漸減少，這一規(guī)律在兩種藥物中均適應(yīng)。2.5 mg/mL的NK和LK溶解血栓時(shí)間分別為21 min和12 min;0.5 mg/mL的NK和LK溶解時(shí)間則分別為60 min和39 min（見圖3）。在相同條件下，LK溶解血栓的時(shí)間比NK少;藥物作用一定時(shí)間后，血栓溶解速率加快，面積-時(shí)間曲線變陡?？赡苡捎诔掷m(xù)的注射，加之管道有所阻塞使得流動(dòng)液量變小，所受阻力增大，溶液在管道有所積累，導(dǎo)致之后溶解速率加快;另一方面藥物已和血栓充分接觸，血栓溶解作用增強(qiáng)。隨后血栓溶解速率變緩。

隨著藥物濃度的增加，血栓溶解速率也增加;在相同條件下，LK的平均溶解速率比NK大（見表2）。LK來源于動(dòng)物組織，NK來源于微生物組織，可能因?yàn)閬碓床煌琇K對(duì)人體血栓溶解作用更好[7]。在接近靜止?fàn)顟B(tài)下，NK和LK溶栓時(shí)間分別可達(dá)260 min和150 min。血小板豐富的血栓不容易溶解，血小板被激活后可以抑制血液內(nèi)纖溶酶的產(chǎn)生，并通過釋放的纖溶酶原激活劑的抑制劑＼|1（PAI＼|1）和α2-抗纖溶酶中和纖溶酶。此外，血小板通過它們的αⅡbβ3受體連接到纖維蛋白上引起凝塊縮回，這可能阻止了纖維蛋白溶解劑在血栓內(nèi)的擴(kuò)散[13]。在流動(dòng)條件下，小的纖維直接通過溶栓藥物進(jìn)行滲透溶解，大的凝塊從外部開始溶解，包括外緣小的纖維和栓塊。隨著管道內(nèi)液體的流動(dòng)，溶解產(chǎn)生的碎片立即被運(yùn)走;同時(shí)加強(qiáng)了藥物的滲透作用，血栓逐漸變小以致消失。對(duì)比近靜止?fàn)顟B(tài)下的血栓溶解，高流速明顯增加了血栓的溶解速率。gzslib202204012111

1.2.3 熒光成像

紅色熒光素羅丹明（Rhodamine B isothiocyanate， RBITC）標(biāo)記的纖維蛋白和綠色異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 標(biāo)記的纖維蛋白原均在血栓熒光圖中存在（見圖4），說明血栓中同時(shí)存在纖維蛋白和纖維蛋白原。兩種熒光在蚓激酶作用下隨著溶解時(shí)間的延長(zhǎng)變的越來越弱，說明蚓激酶可以同時(shí)減少纖維蛋白和纖維蛋白原。在溶解時(shí)，面積和熒光強(qiáng)度有同樣的降低趨勢(shì)，溶解時(shí)間越長(zhǎng)，它們變的越小，甚至為0（見圖5）。有時(shí)該值有所增大，其原因?yàn)楣艿纼?nèi)觀測(cè)處上游血栓降解碎片隨著液體的流動(dòng)在該處有所停滯。蚓激酶還可以激活纖溶酶原，間接溶栓;吸附并水解凝血因子，發(fā)揮間接抗凝作用[7]。蚓激酶可作為一種有效的溶栓藥物進(jìn)行血栓疾病的治療。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 芯片制備

用光刻蝕法制備芯片。在硅片表面覆蓋一層光刻膠，透過光學(xué)掩膜將光刻膠暴露于紫外燈下，將芯片模型轉(zhuǎn)移到芯片上，蝕刻未暴露的光刻膠。將成型的光刻膠作為模板，覆蓋PDMS，固化后將帶有底片的PDMS 結(jié)構(gòu)取下，連接在載玻片上，85 ℃烘烤3 d。進(jìn)口和出口處連接帶有醫(yī)用級(jí)聚乙烯管的不銹鋼管，連接注射泵進(jìn)行液體的灌注。用質(zhì)量濃度75%乙醇清洗芯片，再用蒸餾水清洗。注入230 μg/mLⅠ型酸溶性膠原蛋白 （溶劑濃度為0.5 mol/L乙酸，pH2.8），潮濕環(huán)境下放置60 min，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去多余的未吸附的蛋白，置于潔凈環(huán)境下備用[14-15]。

2.2 血栓形成

抽取正常人體的新鮮血液，立即與質(zhì)量濃度為3.2%檸檬酸鈉溶液混合（體積比為1∶9），在轉(zhuǎn)速為800 r/min、溫度20 ℃條件下，離心15 min取上清液，獲得血小板豐富的血漿，-70 ℃保存。用時(shí)將冷凍的血漿樣品在溫度37 ℃水浴中解凍3 min。用注射泵將血小板豐富的血漿注入不同管徑的芯片管道內(nèi)，流速為1.5 μL/min;同時(shí)注入0.14 U/μL的凝血酶，流速為0.5μL/min，反應(yīng)10 min。用顯微鏡觀察整個(gè)血栓形成過程。

2.3 血栓溶解

2.3.1 不同管徑對(duì)血栓溶解的影響

血漿和凝血酶分別按2.2中濃度和流速注入3種不同管徑（寬分別為100、200、300 μm）的芯片反應(yīng)10 min，以1.5 μL/min的流速注入納豆激酶和蚓激酶（質(zhì)量濃度1.5 mg/mL），用顯微鏡實(shí)時(shí)觀察其溶解過程。在特定區(qū)域至少檢測(cè)3組，溶解時(shí)間顯示其標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD）。選擇血栓形成量適宜和溶解速度適中的管徑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 不同濃度藥物對(duì)血栓溶解的影響

形成穩(wěn)定血栓后，納豆激酶和蚓激酶分別以0.5、1.5和2.5 mg/mL質(zhì)量濃度注入芯片內(nèi)，流速均為1.5 μL/min。同時(shí)設(shè)置低流速對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即以緩慢流速0.2 μL/min注入納豆激酶和蚓激酶（質(zhì)量濃度1.5 mg/mL），研究動(dòng)態(tài)和近似靜態(tài)條件下的血栓溶解過程。為了進(jìn)一步比較不同質(zhì)量濃度下的血栓溶解速率，平均溶解速率可由如下公式計(jì)算：

Rt=（Si-Sf）/T

式中：Rt為平均溶解速率;Si和Sf分別為初始和最終血栓的面積（面積為任意單位）;T為總?cè)芙鈺r(shí)間。

2.3.3 熒光成像

為了清楚地觀察溶解過程中血栓構(gòu)成物質(zhì)的變化，在已形成血栓的芯片內(nèi)加入10 μL鼠抗人纖維蛋白抗體（50 μg/mL），4 ℃過夜，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗除去未結(jié)合的抗體。加入10 μL RBITC標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白M（IgM）（100 μg/mL），4 ℃條件下反應(yīng)12 h，用來標(biāo)記血栓中的纖維蛋白。然后，用PBS清洗后，加入10 μL FITC連接的羊抗人纖維蛋白原抗體（100 μg/mL）標(biāo)記血栓中的纖維蛋白原，4 ℃過夜反應(yīng)后用磷酸鹽緩沖液清洗除去多余未反應(yīng)抗體。用熒光顯微鏡觀察不同時(shí)間特定區(qū)域血栓的變化情況，用Image-Pro Plus 6.0分析計(jì)算累計(jì)熒光密度值和相應(yīng)的面積。

3 結(jié)語

用微流控芯片模擬體內(nèi)血管環(huán)境，光透性好，在顯微鏡下可清晰的觀察整個(gè)反應(yīng)過程;體積較小，每次所用樣品量?jī)H需幾十微升，可以同時(shí)在不同管徑通道進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)迅速，大大減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。本研究所設(shè)計(jì)模型成功實(shí)現(xiàn)了體外模擬血管內(nèi)血栓的形成，并可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物溶栓過程。與體外靜態(tài)、攪拌或開放式流動(dòng)條件下的血栓形成和溶解模型相比，該體系為類似封閉環(huán)境，用注射泵控制液體流速，管道內(nèi)通過擴(kuò)散和壓力介導(dǎo)的滲透效應(yīng)使得溶栓酶能更好地作用于血栓，更加符合真實(shí)血管中藥物作用情況。通過熒光標(biāo)記，可以進(jìn)一步研究藥物的作用機(jī)制。該研究結(jié)果有利于增強(qiáng)血栓體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的連接，開發(fā)新的溶栓藥物，對(duì)血栓栓塞類疾病的基礎(chǔ)研究具有重要意義。

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