響應(yīng)面法優(yōu)化油橄欖葉總酚溶劑浸提工藝

王碧霞，黃婷鈺，周君林

(西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

油橄欖(Oleaeuropaea)又名洋橄欖、齊墩果，為木犀科(Oleaceae)常綠喬木，與油茶、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，其鮮果含油率為30%左右，素有“食用植物油皇后”的美稱[1]。油橄欖因具有油果兩用而被全世界廣泛栽培，中國(guó)于1964年開(kāi)始引種，目前已分布在四川、甘肅、貴州、云南等12個(gè)省市，面積約8×104hm2[2]。隨著我國(guó)油橄欖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，產(chǎn)生大量油橄欖葉，每年修枝剪葉累積的葉子多達(dá)6×105t[3-4]，因缺乏油橄欖葉的利用渠道，葉子被直接丟棄或焚燒，造成巨大的資源浪費(fèi)，引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)惡化[5]。

油橄欖葉在地中海地區(qū)用于民間醫(yī)藥已有數(shù)千年歷史，能直接用于治療退燒、瘧疾、痛風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕病、癱瘓、腹部絞痛和糖尿病等疾病，被寫(xiě)入《歐洲藥典》[6-7]。油橄欖葉潛在的藥理作用引起了學(xué)者的極大關(guān)注，如Romani等[8]發(fā)現(xiàn)油橄欖葉中含有豐富的酚類(lèi)化合物，主要為黃酮類(lèi)、酚醇類(lèi)、酚酸類(lèi)、裂環(huán)烯醚萜類(lèi)等；還有研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖葉富含多酚、黃酮、萜類(lèi)、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等諸多對(duì)人和動(dòng)物有益的活性物質(zhì)，比橄欖油高出100倍[9]，但大多數(shù)研究都將油橄欖葉的健康益處歸因于其主要含有的酚類(lèi)成分[6,8,10]。國(guó)外對(duì)油橄欖葉的研究已較深入，研究區(qū)域主要集中在歐洲和地中海地區(qū)等主產(chǎn)國(guó)，而國(guó)內(nèi)相對(duì)滯后，僅關(guān)注在橄欖油加工、良種選育和集約栽培等方面[11-12]，對(duì)油橄欖葉提取加工的關(guān)注甚少。

目前，國(guó)內(nèi)利用油橄欖葉進(jìn)行活性成分提取并制備提取物時(shí)，大多采用簡(jiǎn)單水提或醇提后直接噴霧干燥，其提取物中酚類(lèi)活性成分含量低[13]。每種植物材料都具有其獨(dú)特的特性，提取得率能否提高不僅受熱穩(wěn)定性、pH、溶劑類(lèi)型等參數(shù)的影響，還與溫度和萃取時(shí)間等因素有關(guān)[14]。有資料顯示，油橄欖葉提取時(shí)料液比通常浮動(dòng)在10%～50%干重(DW)范圍內(nèi)，增加固液比獲得的油橄欖葉總酚(TP)得率更高[15]。還有研究為縮短提取過(guò)程，專注于減少提取時(shí)間(從24 h到15 min)，探討了使用功率超聲改善橄欖葉酚類(lèi)提取的可行性，發(fā)現(xiàn)減少時(shí)間并不改變提取物成分[16]。我國(guó)在提取和純化方面尚缺乏高效率、低成本的技術(shù)工藝，大量提取、工廠化生產(chǎn)、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展還存在技術(shù)瓶頸。響應(yīng)面優(yōu)化(RSM)自從Box and Wilson[17]第一次成功運(yùn)用后，已普遍應(yīng)用于許多植物化學(xué)物質(zhì)的優(yōu)化提取，Box-Behnken Design (BBD)設(shè)計(jì)因其因素水平少、試驗(yàn)次數(shù)少的優(yōu)點(diǎn)近年來(lái)在食品工業(yè)中得到較大關(guān)注[18]。本研究為提高油橄欖葉TP得率，運(yùn)用環(huán)保、高效及操作簡(jiǎn)便的溶劑浸提技術(shù)，在單因素基礎(chǔ)上采用BBD模型設(shè)計(jì)優(yōu)化提取參數(shù)，建立最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖葉于2019年9月采自四川涼山州西昌市北河油橄欖種植基地，品種為白橄欖。蒸餾水沖洗，干燥，粉碎后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩](méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海碩光科技公司，無(wú)水乙醇、碳酸鈉和福林酚試劑均為分析純，購(gòu)于成都科龍化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油橄欖葉中TP的提取

準(zhǔn)確稱取油橄欖葉粉末1 g，加乙醇溶劑浸提，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液后定容。

1.2.2 油橄欖葉中TP的測(cè)定

采用福林酚顯色法測(cè)定TP得率[19]。取油橄欖葉提取液0.1 mL于10 mL容量瓶，加0.25 mL福林酚試劑，再加入1 mL Na2CO3(7%)，用去離子水(Milli-Q Plus System)定容至10 mL，搖勻避光，室溫靜置90 min，于760 nm檢測(cè)吸光值。以分析純沒(méi)食子酸(98%)為標(biāo)準(zhǔn)品，x為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，y為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為y=4.4449x-0.0889(R2=0.9979)。在沒(méi)食子酸0.05～0.20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。取一定量稀釋后的油橄欖葉提取液，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出樣品TP濃度，TP得率(Y)計(jì)算公式為：Y(%)=(C×V×N)/(n×1 000)×100，式中：W為樣品液中TP質(zhì)量濃度；V為樣品液體積；N為稀釋倍數(shù)；n為初始油橄欖葉質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以TP得率為指標(biāo)，運(yùn)用傳統(tǒng)的溶劑浸提法，分別考察4個(gè)影響因素。提取溫度：40、50、60、70、80 ℃(乙醇濃度80%，時(shí)間30 min，料液比1∶30 g·mL-1)；乙醇濃度：50%、60%、70%、80%、90%(提取溫度70 ℃，時(shí)間30 min，料液比1∶30)；提取時(shí)間：20、30、40、50、60 min(提取溫度70 ℃，乙醇濃度80%，料液比1∶30)；料液比：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(提取溫度70 ℃，乙醇濃度80%，時(shí)間30 min)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件，選用BBD模型，以油橄欖葉TP得率為響應(yīng)值，提取溫度、料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度為自變量(表1)。

表1 影響因素水平編碼表

1.2.5 模型的驗(yàn)證

分別對(duì)影響因素進(jìn)行多元二次回歸分析，獲得TP的最佳提取條件。在最佳條件下，重復(fù)3次試驗(yàn)。分析實(shí)測(cè)值和模型預(yù)測(cè)值有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)TP得率的影響

從圖1A可知，在50%～60%乙醇濃度條件下，油橄欖葉TP得率隨著乙醇濃度的升高而升高，在60%乙醇濃度時(shí)最大，超過(guò)60%得率逐漸降低。因此，選擇乙醇濃度為50%、60%、70%進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.1.2 提取溫度對(duì)TP得率的影響

從圖1B可以看出，溫度在40～60 ℃時(shí)，TP得率沒(méi)有顯著變化，當(dāng)溫度升高到70 ℃時(shí)，TP得率顯著增加并達(dá)到最大值16.28%，當(dāng)溫度繼續(xù)升高至80 ℃時(shí)，得率卻下降為15.36%。這可能是因?yàn)樘崛囟壬?，物質(zhì)溶解度增加；同時(shí)，粘度和表面張力溶劑在較高溫度下會(huì)降低，這有助于溶劑到達(dá)樣品，提高提取得率。然而，許多酚類(lèi)化合物易于水解和氧化，較長(zhǎng)的萃取時(shí)間和高溫會(huì)增加酚類(lèi)物質(zhì)的氧化并降低提取物中酚類(lèi)物質(zhì)的得率。因此，選擇提取溫度分別為60、70、80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.1.3 料液比對(duì)TP得率的影響

從圖1C可知，料液比從1∶10增加到1∶20時(shí)，TP得率升高，并達(dá)到最高值14.96%，但當(dāng)增加到1∶30 和1∶40時(shí)，得率卻逐漸下降。由于料液比在1∶10、1∶20、1∶30、1∶40時(shí)，TP得率沒(méi)有顯著差異，如果有機(jī)溶劑與水的比例過(guò)小為1∶10時(shí)，提取過(guò)程中液相濃度高，兩相間的濃度差減少更快，不利于提取得率的穩(wěn)定。因此，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)TP得率的影響

從圖1D可以看出，提取時(shí)間從20 min 延長(zhǎng)到50 min時(shí)，TP得率持續(xù)上升，在50 min時(shí)達(dá)到最大值15.70%，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)到60 min時(shí)，TP得率下降。這表明提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能引起部分酚類(lèi)成分降解，從而導(dǎo)致TP得率降低，且過(guò)長(zhǎng)的浸提時(shí)間也會(huì)增加提取成本。因此，進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí)提取時(shí)間選擇40、50、60 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)，根據(jù)BBD模型，測(cè)定了29種組合所對(duì)應(yīng)的TP得率(表2)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到油橄欖葉TP得率(Y)對(duì)提取溫度(X1)、料液比(X2)、提取時(shí)間(X3)、乙醇濃度(X4)的二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y=18.60-0.07X1+0.48X2+0.29X3-0.15X4+1.00X1X2-0.57X1X3-0.48X1X4-1.51X2X3-1.88X2X4+0.21X3X4-1.95X12-1.90X22-0.97X32-1.20X42。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，以確定各因素對(duì)油橄欖葉TP得率的影響程度，對(duì)該模型進(jìn)行了方差分析(表3)。該模型的P<0.0001，失擬項(xiàng)(P=0.1992)不顯著，說(shuō)明該模型的擬合度高。同時(shí)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9762(>0.75)，說(shuō)明模型準(zhǔn)確性較高[20]。校正決定系數(shù)Adj.R2=0.9523，表明由提取溫度(X1)、料液比(X2)、提取時(shí)間(X3)及乙醇濃度(X4)的變化引起響應(yīng)值95.23%的變化；且PredR2表示回歸模型在預(yù)測(cè)新觀察值時(shí)的準(zhǔn)確程度，Pred.R2為0.8767，表示該模型可預(yù)測(cè)87.67%的新觀察值。在該模型中，變異系數(shù)為2.28%，這說(shuō)明試驗(yàn)的精度高，可靠性強(qiáng)[21]。此外，信噪比為20.455，表示該回歸模型具有較好的擬合度和穩(wěn)定性。綜上所述，該模型可以優(yōu)化溶劑浸提油橄欖葉中TP得率。

表3 溶劑浸提總酚得率響應(yīng)面回歸模型方差分析

另外，從表3可得，一次項(xiàng)X2較為顯著(P<0.001)，交互項(xiàng)X1X2、X2X3和X2X4均極顯著(P<0.0001)，二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42也極為顯著(P<0.0001)，這些結(jié)果表明它們顯著影響油橄欖葉TP得率。同時(shí)，一次項(xiàng)X3與交互項(xiàng)X1X3、X1X4顯著(P<0.01)。但一次項(xiàng)X1、X4與交互項(xiàng)X3X4卻不顯著，這表明各影響因素與油橄欖葉TP得率之間的關(guān)系并非是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。這說(shuō)明4個(gè)影響因素中，料液比(X2)對(duì)油橄欖葉TP得率影響最大，提取時(shí)間(X3)次之。

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面的3D圖和等高線圖能夠直觀反應(yīng)出響應(yīng)值是否對(duì)該因素的變化反應(yīng)敏感，越陡峭對(duì)響應(yīng)值的影響越大，反之較小[22]。圖2A直觀反映了在提取時(shí)間為50 min和乙醇濃度為60%的固定條件下，提取溫度和料液比(X1X2)對(duì)TP得率具有顯著影響；當(dāng)X1從60 ℃升高到70 ℃，X2從1∶20遞增到1∶35時(shí)，TP得率從15.41%上升到16.16%。圖2B和C也顯示出隨著提取溫度的升高，提取時(shí)間在40～55 min和乙醇濃度在50%～70%內(nèi)逐漸增加時(shí)，TP得率持續(xù)增加，而繼續(xù)增加提取時(shí)間和乙醇濃度時(shí)，TP得率卻沒(méi)有顯著增加。從圖2D可以看出，料液比和提取時(shí)間(X2X3)從1∶20和40 min分別遞增到1∶35和60 min時(shí)，TP得率從13.50%增加到17.07%。同樣，圖2E也反映出料液比和乙醇濃度(X2X4)的交互作用對(duì)TP的影響也極為顯著。當(dāng)料液比和乙醇濃度從1∶20和50%分別遞增到1∶35和65%時(shí)，TP得率從13.43%增加到18.26%，并在1∶35 和70%乙醇濃度時(shí)，得率達(dá)到峰值。然而，提取時(shí)間和乙醇濃度(X3X4)交互作用時(shí)，卻對(duì)TP得率沒(méi)有顯著影響(圖2F)。這些分析結(jié)果也與方差分析結(jié)果相吻合(表3)。

等高線圖的形狀有圓形和橢圓形，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則不顯著[23]。根據(jù)擬合函數(shù)，每?jī)蓚€(gè)影響因子對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值畫(huà)出等高線圖(圖3)。當(dāng)提取溫度在60～80 ℃范圍時(shí)，分別與料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度的交互作用對(duì)TP得率的影響見(jiàn)圖3中A、B和C。同樣，當(dāng)料液比在1∶20～1∶35范圍時(shí)，分別與提取時(shí)間、乙醇濃度的交互作用對(duì)TP得率的影響見(jiàn)圖3D和E，其圖形均呈現(xiàn)出明顯的橢圓形，這表明X1X2、X2X3、X1X4、X2X3、X2X4的交互作用顯著影響了TP得率。然而，提取時(shí)間與乙醇濃度(X3X4)的等高圖為圓形(圖3F)，這表明二者的交互作用對(duì)TP得率沒(méi)有顯著影響。

2.2.4 模型驗(yàn)證

根據(jù)試驗(yàn)所建立的模型，預(yù)測(cè)提取油橄欖葉TP的最佳條件為：提取溫度74.95 ℃，料液比1∶40 g·mL-1，乙醇濃度50%，提取時(shí)間41.19 min，此條件下TP得率為18.60%。為實(shí)際操作的可行性和方便性，將此優(yōu)化的工藝條件調(diào)整為：提取溫度75 ℃、乙醇濃度50%、料液比1∶40 g·mL-1、提取時(shí)間40 min，此條件下TP實(shí)際平均得率為18.98%±2.00%(n=3)，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小。這表明響應(yīng)面法成功運(yùn)用于優(yōu)化油橄欖葉TP的溶劑浸提工藝，其提取條件較為可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 討 論

溶劑浸提法在實(shí)際生產(chǎn)中是提取活性成分最傳統(tǒng)的方法之一，因操作簡(jiǎn)單，其應(yīng)用范圍較為廣泛[24-25]。該浸提方法利用相似相溶原理提取材料酚類(lèi)成分，其提取效率受溶劑類(lèi)型、固液兩相的接觸面積、相對(duì)運(yùn)動(dòng)、提取溫度、pH等因素的影響。選擇合適的溶劑會(huì)影響提取的酚類(lèi)成分及其含量，乙醇是TP提取的一種良好溶劑，對(duì)人類(lèi)健康較為安全[26-28]。在本研究中，由于油橄欖葉中酚類(lèi)物質(zhì)大都含有多個(gè)羥基，有很強(qiáng)的極性，乙醇極性也較強(qiáng)，是能與水互溶的有機(jī)溶劑，因此在選擇溶劑時(shí)主要以親水性溶劑乙醇作為提取試劑。

本研究運(yùn)用溶劑浸提法從油橄欖葉中提取TP，在提取溫度75 ℃、乙醇濃度50%、料液比1∶40 g·mL-1、提取時(shí)間40 min的最佳提取條件下，TP實(shí)際平均得率為18.98%。饒瑜等[25]采用乙醇溶劑浸提廣元地區(qū)油橄欖葉多酚物質(zhì)，其橄欖葉多酚得率為57.22 mg·g-1，其最佳工藝條件為乙醇濃度60%、浸提時(shí)間1.75 h、料液比1∶35 g·mL-1、浸提溫度為55 ℃。與他相比，在單因素基礎(chǔ)上，運(yùn)用BBD模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，在本工藝條件下提取效率更高，提取時(shí)間更短，乙醇濃度也更低。這表明溶劑浸提油橄欖葉TP工藝是可以根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的需要和具體條件加以運(yùn)用的提取技術(shù)。