羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)與乳化性能的影響

馬思麗，楊 波，李亞蕾，羅瑞明，馬旭華

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

肉及肉制品在加工貯藏過程中極易受到溫度、光照和氧氣等外界條件的影響而導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化，致使肉品質(zhì)量下降，品質(zhì)劣變嚴(yán)重[1-2]。蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變，包括氨基酸側(cè)鏈的修飾、蛋白質(zhì)肽鏈骨架的斷裂、蛋白分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)或聚合等，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)凝膠性和乳化性等功能特性的改變[3]。

目前，關(guān)于蛋白質(zhì)功能特性方面的研究，多集中于氧化對肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)與凝膠特性的影響，而關(guān)于氧化對肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化與乳化性能的研究較少，且現(xiàn)有研究報(bào)道結(jié)果不一致。Sun Weizheng等[4]采用Fenton體系構(gòu)建羥自由基氧化體系（H2O2濃度分別為0、0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、10 mmol/L），并于37 ℃將豬肌原纖維蛋白（蛋白終質(zhì)量濃度10 mg/mL）氧化孵育3 h，探究化學(xué)氧化對豬肌原纖維蛋白乳化特性的影響，發(fā)現(xiàn)隨H2O2濃度的增加，肌原纖維蛋白的電荷、表面活性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)氧化對肌原纖維蛋白的乳化性能有負(fù)面影響。岳開華等[5]采用羥自由基氧化體系（FeCl3、抗壞血酸濃度均為0.1 mmol/L，H2O2濃度分別為1、5、10 mmol/L）于4 ℃條件下對海鱸魚肌原纖維蛋白（蛋白終質(zhì)量濃度10 mg/mL）分別氧化2、4、6 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一氧化時間下，蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨氧化劑濃度增加呈下降趨勢，而同一氧化劑濃度下，蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨氧化時間的延長逐漸降低。李艷青[6]采用羥自由基氧化體系（FeCl3、抗壞血酸濃度均為0.1 mmol/L，H2O2濃度分別為0、0.1、1、5、10、20 mmol/L）于4 ℃條件下將鯉魚肌原纖維蛋白（蛋白終質(zhì)量濃度20 mg/mL）分別氧化孵育1、3、5 h，發(fā)現(xiàn)同一氧化時間下，隨H2O2濃度的升高，鯉魚肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢；而張麗等[7]采用羥自由基氧化體系（0.01 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸，H2O2濃度分別為0.3、0.4、0.5 mmol/L）于4 ℃條件下將牦牛肌原纖維蛋白（蛋白終質(zhì)量濃度（15±0.5）mg/mL）氧化孵育24 h，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)氧化對牦牛肌原纖維蛋白的溶解性和乳化性有一定改善作用?？梢?，關(guān)于氧化強(qiáng)度對肌原纖維蛋白乳化性能的影響還需進(jìn)一步研究。

在宰后成熟過程中引起肉品蛋白質(zhì)氧化的途徑有羥自由基氧化、高鐵肌紅蛋白氧化和脂質(zhì)氧化3 種[8]，其中羥自由基氧化被認(rèn)為是鮮肉氧化的主要原因，它直接影響肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)[6]。牛肉富含人體必需氨基酸，具有高蛋白質(zhì)、低脂肪和低膽固醇等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛，但其在貯藏加工過程中易受到氧化的影響[9]，因此，本研究主要針對牛肌原纖維蛋白，借助Fenton氧化體系構(gòu)建羥自由基體外模擬氧化體系，分析不同氧化強(qiáng)度下肌原纖維蛋白理化特性、交聯(lián)降解情況、結(jié)構(gòu)以及乳化性能的變化，探究蛋白質(zhì)氧化程度、結(jié)構(gòu)變化和乳化性能的內(nèi)在聯(lián)系，以期為肉及肉制品的加工和貯藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮秦川牛肉采自寧夏涇源縣清苑牧業(yè)有限公司，選取6 頭48 月齡生長發(fā)育良好、體況相近、健康無病的秦川公牛（去勢），屠宰后立即取背最長肌，真空包裝置于裝有冰袋的保溫箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

脲（尿素）、磷酸鈉（磷酸三鈉）、磷酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%）、氫氧化鈉（粒狀）（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸鈉、無水氯化鎂、考馬斯亮藍(lán)R250、鹽酸胍、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylene bis(2-oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；2,4-二硝基苯肼（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%）、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；冰乙酸（優(yōu)級純）、過氧化氫（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-24M高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SJ-3F便攜式pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀、JXH-100恒溫混勻儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料預(yù)處理

在實(shí)驗(yàn)室剔除牛背最長肌多余脂肪與結(jié)締組織后，分割成大小薄厚均等的肉塊（3 cm×3 cm×3 cm），無菌生理鹽水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面水分，立即用液氮冷凍2 h，然后置于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考Park等[10]的方法并作適當(dāng)修改。稱取適量已切碎的肉樣，按料液比1∶4（g/mL）加入分離緩沖液（0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Na3PO4、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA，pH 7.0）混合，8 000 r/min勻漿30 s，暫停1 min，以同樣轉(zhuǎn)速再勻漿30 s，勻漿液過80 目篩，然后濾液在4 ℃、2 000×g離心15 min，收集沉淀。采用上述相同的混合和離心條件，重復(fù)操作2 次。所得沉淀按料液比1∶4（g/mL）加入0.1 mol/L NaCl溶液洗滌，離心2 次后收集沉淀即為肌原纖維蛋白，于4 ℃冷藏，24 h內(nèi)用完。

1.3.3 肌原纖維蛋白的氧化

參考Xiong Youling[11]和方海硯[12]等的方法構(gòu)建Fenton氧化體系：0.01 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L VC，H2O2濃度分別為0.5、1、5、10、20 mmol/L，以上氧化體系在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.0）中進(jìn)行。將提取出的肌原纖維蛋白均勻分散于構(gòu)建的氧化體系中（蛋白終質(zhì)量濃度15 mg/mL），在4 ℃條件下氧化24 h后加入終濃度1 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，冷凍離心（4 ℃、4 000 r/min，10 min），沉淀用5 倍體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解，4 ℃、2 000×g離心15 min，收集沉淀，重復(fù)洗滌2 次以除去氧化劑。以肌原纖維蛋白分散于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mmol/L NaCl，pH 6.0，蛋白終質(zhì)量濃度15 mg/mL）為對照組，于4 ℃放置24 h，其余操作同氧化組。

1.3.4 羰基含量的測定

參考Oliver等[13]的方法并作適當(dāng)修改。用0.1 mol/L KCl溶液將肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為5 mg/mL，用2,4-二硝基苯肼反應(yīng)測定羰基含量，摩爾吸光系數(shù)為22 000 L/（mol·cm）。

1.3.5 總巰基和游離巰基含量的測定

參考Yongsawatdigul等[14]的方法并稍作修改。

總巰基含量：取0.5 mL 1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液加入10 mL離心管中，每管加入4.5 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素，pH 8.0），混勻后加入0.5 mL Ellman試劑，渦旋混勻后在30 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后在波長412 nm處測定吸光度。

游離巰基含量：在不含尿素的情況下，于30 ℃反應(yīng)30 min，其余操作同上。

根據(jù)巰基摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）按式（1）計(jì)算巰基含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以每毫克蛋白所含巰基物質(zhì)的量表示。用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白含量。

式中：A為樣品組在412 nm波長處的吸光度；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；11為稀釋倍數(shù)。

1.3.6 二聚酪氨酸含量的測定

參考張麗等[7]的方法并加以修改，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 6.0）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度，溶液經(jīng)過濾除去不溶物質(zhì)后，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)量濃度。用熒光分光光度計(jì)測定吸光度，發(fā)射波長420 nm，激發(fā)波長325 nm，狹縫寬度10 nm。二聚酪氨酸含量以相對熒光值（即吸光度除以蛋白質(zhì)量濃度）表示。

1.3.7 表面疏水性的測定

參考Chelh等[15]的方法并稍作修改，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 6.0）將蛋白質(zhì)溶液稀釋至1 mg/mL。取1 mL稀釋后的蛋白質(zhì)溶液加入80 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液混勻，室溫下攪拌10 min，7 000 r/min離心15 min，取上清液以20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 6.0）稀釋10 倍后，測定595 nm波長處吸光度。以1 mL 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）加入80 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液作為空白組。表面疏水性按式（2）計(jì)算：

式中：A空白為空白組在595 nm波長處的吸光度；A樣品為樣品組在595 nm波長處的吸光度。

1.3.8 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定

參考Li Ke等[16]的方法并稍作修改，將氧化后的肌原纖維蛋白膏真空冷凍干燥后，與干燥的溴化鉀按質(zhì)量比1∶150充分混合，用瑪瑙研缽碾磨，然后將粉末放入壓片機(jī)中制成薄片。用傅里葉紅外光譜儀采集光譜數(shù)據(jù)，掃描范圍4 000～400 cm－1，掃描64 次，分辨率4 cm－1。獲得1 700～1 600 cm－1的吸收光譜，用于酰胺Ⅰ帶分析。利用PeakFit 4.12軟件對1 700～1 600 cm－1波段內(nèi)的光譜圖進(jìn)行傅里葉自動去卷積和二階導(dǎo)數(shù)峰擬合，計(jì)算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)卷曲的相對含量。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參考Shen Hui等[17]的方法并稍作修改，將不同氧化程度的肌原纖維蛋白懸濁液（4 mg/mL）與50 mmol/L Tris緩沖液（8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、3 g/100 mL SDS、0.05%溴酚藍(lán)、20%（V/V）甘油，pH 6.8）按體積比1∶1混合，沸水浴中加熱5 min，然后5 000 r/min離心5 min，取15 μL上清液加入到5%的濃縮膠中，用10%的分離膠分離樣品。先以80 V恒壓電泳至濃縮膠與分離膠分界處，再以120 V恒壓電泳至底部。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色30 min，然后在甲醇-冰醋酸-蒸餾水（2.5∶1∶6.5，V/V）中脫色12 h。

1.3.10 肌原纖維蛋白溶解度的測定

參照Wang Shuangxi等[18]的方法并略加修改。用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.0）將蛋白質(zhì)溶液稀釋至2 mg/mL， 5 000×g離心10 min，收集上清液。采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中蛋白含量。計(jì)算上清液中蛋白含量與原溶液中蛋白含量的百分比即為肌原纖維蛋白溶解度。

1.3.11 肌原纖維蛋白濁度的測定

用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.0）將蛋白溶液稀釋至1 mg/mL，吸取5 mL于試管中，分別于30、40、50、60、70、80 ℃水浴30 min后取出，冷卻后以不加蛋白的溶液為空白，在600 nm波長處測定吸光度。濁度以A600nm表示。

1.3.12 肌原纖維蛋白乳化性能的測定

參考劉娟[19]的方法。肌原纖維蛋白溶解于0.1 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液中，蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL，將2.0 mL大豆油和8.0 mL蛋白溶液放入直徑2.5 cm塑料離心管中，10 000 r/min高速勻漿1 min，立即從距離心管底0.5 cm處取勻漿液50 μL，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后在500 nm波長處測定吸光度A0，靜置10 min后再次在相同位置取勻漿液50 μL，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后測定吸光度A10，用0.1% SDS溶液作空白對照。肌原纖維蛋白勻漿液的乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsification stability index，ESI）分別按式（3）、（4）計(jì)算：

式中：φ為油相體積分?jǐn)?shù)（0.2）；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)羰基化合物是肉類在貯藏過程中蛋白質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物。因此，蛋白質(zhì)的羰基含量是評價蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)之一[20]。由圖1可知，隨H2O2濃度的增加，羰基含量顯著增加（P＜0.05）。對照組（0 mmol/L H2O2）羰基含量為1.69 nmol/mg，當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時，羰基含量為5.33 nmol/mg，相比對照組增加了2.15 倍，這說明隨H2O2濃度的增加，產(chǎn)生的羥自由基含量逐漸增加，肌原纖維蛋白的氧化程度也隨之加劇。

圖1 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白中羰基含量的變化Fig. 1 Changes in carbonyl content in myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical

2.2 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白總巰基和游離巰基含量的影響

巰基的減少是氧化攻擊下蛋白質(zhì)變化的主要共同特征之一[11]。由圖2可知，隨H2O2濃度的增加，總巰基和游離巰基含量均顯著降低（P＜0.05）。對照組（0 mmol/L H2O2）總巰基含量和游離巰基含量分別為68.71 nmol/mg和64.32 nmol/mg，當(dāng)H2O2濃度增加至20 mmol/L時，總巰基含量和游離巰基含量分別降至62.46 nmol/mg和48.68 nmol/mg，較對照組相比，分別降低了9.10%和24.32%。這可能是因?yàn)榧≡w維蛋白巰基容易被活性氧自由基攻擊，轉(zhuǎn)化為二硫鍵、亞磺酸、磺酸或被一氧化氮亞硝酰化[21]。

圖2 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白中總巰基、游離巰基含量的變化Fig. 2 Changes in contents of total sulfhydryl and free sulfhydryl groups in myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical

2.3 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

酪氨酸也容易受到活性氧的攻擊，產(chǎn)生的酪氨酸自由基和酪氨酸殘基形成二酪氨酸[22]。由圖3可知，隨H2O2濃度的增加，二聚酪氨酸含量呈上升趨勢（P＜0.05），對照組中二聚酪氨酸含量為25.06，當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時，二聚酪氨酸含量為63.18，較對照組增加了1.52 倍。

圖3 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白中二聚酪氨酸含量的變化Fig. 3 Change in dimer tyrosine content in myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical

2.4 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性即蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸的含量，可以用來評估蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[22]。由圖4可知，隨H2O2濃度的增加，肌原纖維蛋白表面疏水性呈上升趨勢（P＜0.05）。對照組中肌原纖維蛋白溴酚藍(lán)結(jié)合量為30.17 μg，當(dāng)H2O2濃度增加至20 mmol/L，溴酚藍(lán)結(jié)合量為55.04 μg，與對照組相比肌原纖維蛋白表面疏水性增加82.43%。

圖4 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig. 4 Change in surface hydrophobicity of myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical

2.5 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

1 700～1 600 cm－1波段主要由C=O的伸縮振動引起，該波段紅外光譜可用于蛋白二級結(jié)構(gòu)分析[4]。由表1可知，隨H2O2濃度的增加，蛋白質(zhì)氧化程度加劇，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對含量呈下降趨勢（P＜0.05），β-折疊呈上升趨勢（P＜0.05），β-轉(zhuǎn)角整體呈下降趨勢，無規(guī)卷曲則整體呈上升趨勢，這說明氧化對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有影響，使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)變。

表1 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的相對含量變化Table 1 Changes in secondary structures of myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical %

2.6 不同氧化強(qiáng)度肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析

圖5 不同氧化強(qiáng)度肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 5 SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein oxidized to different degrees

如圖5所示，條帶由上到下依次出現(xiàn)245 kDa的肌球蛋白重鏈、43 kDa的肌動蛋白以及15～25 kDa的肌球蛋白輕鏈。隨H2O2濃度的增加，肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈條帶灰度逐漸變淺，說明氧化對肌球蛋白有影響；肌動蛋白條帶灰度在0.5～1 mmol/L H2O2時略微減弱，說明氧化對肌動蛋白的影響較肌球蛋白較小。

2.7 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白溶解度的影響

由圖6可知，隨H2O2濃度的增加，肌原纖維蛋白的溶解度呈先上升后降低的趨勢（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度0～0.5 mmol/L時，溶解度變化不顯著（P＞0.05），H2O2濃度1 mmol/L，溶解度達(dá)到最大值35.22%，較對照組（0 mmol/L H2O2）增加了7.44%，之后隨H2O2濃度的增加，肌原纖維蛋白溶解度顯著降低（P＜0.05），H2O2濃度20 mmol/L溶解度為28.39%，較對照組降低了13.39%。

圖6 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白溶解度的變化Fig. 6 Change in solubility of myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical

2.8 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白濁度的影響

圖7 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白濁度的變化Fig. 7 Change in myofibrillar protein turbidity after oxidation by hydroxyl radical

蛋白溶液加熱后的濁度水平通常用于衡量肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)聚集的變化情況[6]。由圖7可知，不同氧化程度下，蛋白濁度均在40 ℃顯著降低（P＜0.05），這可能是由于蛋白質(zhì)分子展開而導(dǎo)致濁度下降[23]，隨后濁度隨溫度升高呈上升趨勢（P＜0.05），這可能是由于肌原纖維蛋白的分子內(nèi)和分子間相互作用會增強(qiáng)聚集[24]。30 ℃時，20 mmol/L H2O2組蛋白濁度較對照組增加了78.81%，80 ℃時，20 mmol/L H2O2組蛋白濁度增加了1.29 倍。在同一溫度下，蛋白質(zhì)氧化程度越大，濁度越高。以上結(jié)果說明氧化會導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性，增強(qiáng)蛋白的聚集行為，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濁度增加。

2.9 羥自由基氧化對牛肌原纖維蛋白乳化性能的影響

蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)一般用EAI和ESI評價，反映了蛋白質(zhì)形成乳化體系及其穩(wěn)定乳化體系的能力[5]。如圖8所示，隨H2O2濃度的增加，EAI和ESI都呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度為1 mmol/L時，EAI和ESI均達(dá)到最大，分別為18.33 m2/g和31.95%，較對照組分別增加38.13%和20.66%，H2O2濃度20 mmol/L，EAI和ESI分別為8.74 m2/g和20.02%，分別較對照組降低34.18%和24.41%，這說明羥自由基攻擊引起的氧化嚴(yán)重影響了牛肌原纖維蛋白的乳化性能。

圖8 羥自由基氧化后牛肌原纖維蛋白EAI（A）和ESI（B）的變化Fig. 8 Change in emulsification properties of myofibrillar protein after oxidation by hydroxyl radical

2.10 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

表2 各指標(biāo)間的Pearson相關(guān)性Table 2 Pearson correlation coefficients between all indicators tested

通過對牛肌原纖維蛋白在氧化過程中各指標(biāo)之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析（表2）發(fā)現(xiàn)，牛肌原纖維蛋白在氧化過程中，羰基含量與二聚酪氨酸含量（r=0.989，P＜0.01）、表面疏水性（r=0.988，P＜0.01）、β-折疊相對含量（r=0.992，P＜0.01）、濁度（r=0.976，P＜0.01）、無規(guī)卷曲相對含量（r=0.361，P＞0.05）呈正相關(guān)，與其他指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。羰基含量是蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)之一，羰基含量與各指標(biāo)之間均有相關(guān)性，表明羥自由基氧化對肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性均有影響。表面疏水性與濁度（r=0.976，P＜0.01）呈極顯著正相關(guān)，與溶解度（r=－0.783，P＜0.01）、EAI（r=－0.623，P＜0.01）和ESI（r=－0.680，P＜0.01）呈極顯著負(fù)相關(guān)；α-螺旋相對含量與濁度（r=－0.988，P＜0.01）呈極顯著負(fù)相關(guān)，與溶解度（r=0.765，P＜0.01）、EAI（r=0.658，P＜0.01）和ESI（r=0.721，P＜0.01）呈極顯著正相關(guān)；β-折疊相對含量和與濁度（r=0.993，P＜0.01）呈極顯著正相關(guān)，與溶解度（r=－0.778，P＜0.01）、EAI（r=－0.680，P＜0.01）和ESI（r=－0.683，P＜0.01）呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化與乳化性質(zhì)之間有密切聯(lián)系。

3 討 論

羰基主要通過氨基酸側(cè)鏈的直接氧化、與還原糖的非酶羰基反應(yīng)、與非蛋白糖基化化合物的結(jié)合以及多肽鏈的氧化斷裂產(chǎn)生，是蛋白質(zhì)最重要的表征模式[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Fenton氧化體系中，隨H2O2濃度的增加，羰基含量逐漸增加，這表明隨H2O2濃度的增加肌原纖維蛋白氧化程度加劇。崔文斌等[8]的研究指出，牦牛肉在4 ℃氧化24 h后，羰基含量隨H2O2濃度的增加呈上升趨勢，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。扶慶權(quán)[26]采用Fenton氧化體系模擬鮮肉氧化得出相同結(jié)論。巰基的丟失也是肉與肉制品中蛋白質(zhì)氧化的標(biāo)志[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，總巰基和游離巰基含量都隨H2O2濃度的增加逐漸降低，可能是因?yàn)榧≡w維蛋白中的巰基氧化形成多肽分子間或分子內(nèi)二硫鍵，或進(jìn)一步氧化成磺酸類或其他氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致巰基含量的下降[8]。另有研究表明，在自由基氧化體系中，酪氨酸極易被自由基攻擊產(chǎn)生酪氨酸自由基和酪氨酸殘基，形成二聚酪氨酸，因此二聚酪氨酸的含量變化也被用于研究蛋白質(zhì)氧化的程度[25]。本實(shí)驗(yàn)中，隨氧化劑濃度的增加，二聚酪氨酸的含量顯著增加，這與趙冰等[28]在不同濃度H2O2氧化體系中肌原纖維蛋白氧化的研究結(jié)果類似，表明隨H2O2濃度的增加，產(chǎn)生較多的羥自由基，使氨基酸側(cè)鏈被攻擊的幾率變大，進(jìn)而形成更多的酪氨酸自由基和酪氨酸殘基，這些自由基和殘基通過共價鍵與非共價鍵作用形成二聚酪氨酸[23]。

表面疏水性是蛋白質(zhì)變性和水解的良好標(biāo)志[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，表面疏水性與羰基含量呈極顯著正相關(guān)，表明隨氧化程度的增加蛋白質(zhì)表面疏水性呈上升趨勢，這與Shen Hui[17]和Cao Yungang[30]等的研究結(jié)果類似。Estévez[20]提出表面疏水性的增加可能是因?yàn)檠趸瘬p傷誘導(dǎo)肌原纖維蛋白部分解折疊，從而暴露了埋藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸。此外，氧化應(yīng)激下某些肽的裂解也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的增強(qiáng)[31]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要通過骨架上羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持，氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力，二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4 種構(gòu)象組成[12]。本研究結(jié)果表明，隨氧化程度的增加，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量呈下降趨勢，β-折疊和無規(guī)卷曲相對含量呈上升趨勢，表明氧化對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有影響。α-螺旋相對含量下降和β-折疊相對含量增加的原因是羥自由基通過削弱氫鍵改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋逐漸展開，多肽鏈重排形成β-折疊[32]。張海璐等[33]對羊肉中肌原纖維蛋白采用不同程度的體外模擬氧化，發(fā)現(xiàn)隨氧化程度的增加，α-螺旋逐漸降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，表面疏水性與α-螺旋和β-折疊相對含量極顯著相關(guān)，表明蛋白質(zhì)表面疏水性的增加與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。Morzel等[25]指出氧化可能導(dǎo)致蛋白二級結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致溶液中極性和非極性基團(tuán)數(shù)量的改變，因此可能增加表面疏水性。另有報(bào)道稱氧化使埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致分子內(nèi)氫鍵減少，使蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。此外，Xiong Youling等[11]研究發(fā)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊的轉(zhuǎn)變可能對牦牛肌原纖維蛋白的功能特性有影響。此外，張麗等[7]發(fā)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)大多數(shù)指標(biāo)與溶解度、濁度和乳化特性相關(guān)性顯著。這與本研究中相關(guān)性分析結(jié)果類似，表明氧化導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化對其乳化特性等功能性質(zhì)有影響。

SDS-PAGE圖譜顯示在不同氧化強(qiáng)度下蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集和降解情況[11]，蛋白質(zhì)發(fā)生降解主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)條帶的模糊、弱化和擴(kuò)展[34]，這表明氧化在一定程度對蛋白質(zhì)的交聯(lián)降解有影響。本研究發(fā)現(xiàn)隨H2O2濃度的增加，肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈條帶灰度逐漸變淺，說明隨氧化強(qiáng)度的增加，肌球蛋白發(fā)生交聯(lián)。肌動蛋白條帶灰度在0.5～1 mmol/L H2O2時稍有減弱，這說明與肌球蛋白相比，氧化對肌動蛋白的影響較小。Zhang Dong等[35]對不同氧化強(qiáng)度的豬肌原纖維蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶灰度隨氧化程度的增加逐漸變淺。肌球蛋白和肌動球蛋白構(gòu)成了油滴周圍的界面蛋白膜[16]，因此氧化誘導(dǎo)肌球蛋白和肌動蛋白的交聯(lián)可以解釋高氧化強(qiáng)度下肌原纖維蛋白EAI和ESI降低的原因。

由于氧化引起的蛋白交聯(lián)會導(dǎo)致肌原纖維蛋白發(fā)生聚集和沉淀，引起溶解度降低和濁度增加[6]，因此溶解度和濁度都可以表征蛋白質(zhì)聚集的程度[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨H2O2濃度的升高和氧化強(qiáng)度的增加，肌原纖維蛋白的溶解度呈先上升后下降的趨勢，濁度呈先減小后增加的趨勢。Zhang Dong等[35]得出類似結(jié)論。Estévez[20]指出輕微的氧化可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分解折疊，使肌原纖維蛋白的溶解度升高，濁度降低。之后，隨著氧化強(qiáng)度的增加，肌原纖維蛋白的溶解度下降，濁度升高，這可能是因?yàn)檠趸沟鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致分子內(nèi)疏水性基團(tuán)暴露，增加了蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[21]。此外，氧化使蛋白質(zhì)中的巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，也是溶解度降低和濁度增加的原因[37]。

肌原纖維蛋白是良好的乳化劑，因?yàn)槠渚哂袃捎H性結(jié)構(gòu)，可以降低液滴表面張力并穩(wěn)定系統(tǒng)[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨氧化程度的增加，EAI和ESI都呈先上升后下降的趨勢，表明適度氧化對肌原纖維蛋白的乳化性能產(chǎn)生有利影響，而過度氧化則會破壞肌原纖維蛋白的乳化特性。低強(qiáng)度氧化會誘導(dǎo)肌原纖維蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)部分解折疊暴露出較多的疏水基團(tuán)，使肌原纖維蛋白在形成乳液的過程中能更好地吸附在油-水界面，從而有效提升蛋白溶液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[39]。李艷青[6]研究發(fā)現(xiàn)，在Fenton氧化體系中，氧化引起氨基酸側(cè)鏈改變，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白聚集體產(chǎn)生，蛋白不能形成穩(wěn)定的界面膜，從而使其乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降，并指出EAI和ESI與溶解度呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致，即蛋白質(zhì)溶解度越低，乳化活性和乳化穩(wěn)定性也相對越低，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在發(fā)揮乳化作用前需先溶解并轉(zhuǎn)移到表面[40]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，EAI和ESI與表面疏水性和β-折疊相對含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這與Sun Weizheng等[4]的結(jié)論相似，這可能是由于高強(qiáng)度氧化誘導(dǎo)表面疏水性和β-折疊相對含量的增加，造成表面活性和蛋白質(zhì)分子表面作用力減弱，導(dǎo)致界面蛋白膜的黏度降低，乳液液滴間通過疏水相互作用的排斥力增加，從而導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性下降[41-42]。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同氧化強(qiáng)度下，牛肌原纖維蛋白理化特性、結(jié)構(gòu)以及乳化性能的變化及其內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果表明：隨H2O2濃度的增加，羰基含量和二聚酪氨酸含量逐漸增加，總巰基和游離巰基含量下降，表明隨H2O2濃度的增加肌原纖維蛋白的氧化程度加劇。隨氧化程度的增加，表面疏水性和α-螺旋相對含量呈上升趨勢，β-折疊相對含量呈下降趨勢。SDS-PAGE結(jié)果表明氧化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)。溶解度、EAI和ESI都隨氧化程度的增加呈先上升后下降的趨勢，濁度呈先減小后增加的趨勢。相關(guān)性結(jié)果表明氧化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對肌原纖維蛋白的乳化性能有影響。綜上所述，F(xiàn)enton氧化體系中產(chǎn)生的羥自由基能夠顯著促進(jìn)肌原纖維蛋白的氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其乳化性能，因此有必要根據(jù)肌原纖維蛋白的氧化特性和結(jié)構(gòu)變化，實(shí)施相應(yīng)的調(diào)控方案控制蛋白質(zhì)氧化，減少肉品在貯藏與加工過程中的損失。