預混料中維生素E的近紅外光譜定量分析模型定標參考值選取

樊 霞 姜訓鵬 王 石 宋金彩 田淑麗 鄭學聰

(1.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，北京100081；2.藍星安迪蘇南京有限公司，南京210048；3.中糧(北京)飼料科技有限公司，北京100081)

維生素是動物維持生理機能所必需的一類低分子有機化合物，控制著動物機體內的新陳代謝[1]。確定添加劑預混料產品中不同維生素的含量是產品質量控制和精準飼喂的重要基礎。飼料中維生素的國家標準檢測方法一般為高效液相色譜法[2-4]，但該方法操作復雜、耗時長、儀器設備投入大，對檢測人員的技能經驗要求高，難以滿足飼料廠和養(yǎng)殖場在精細生產、精準飼喂下的高通量篩查需求。近紅外光譜(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)法因具有操作簡單、快速、無損等特點，已被成熟應用于飼料的高通量檢測[5-7]，并部分形成了國家標準方法[8-9]。在研發(fā)構建飼料中維生素含量測定的NIRS法中，定標參考值選取制約著NIRS定量分析模型的快速構建和應用。因維生素檢測投入大和周期長，且維生素組分眾多，目前見諸報道的NIRS定量分析模型有維生素A[10]、維生素E[11-12]等11種維生素[13-14]。為滿足飼料廠和養(yǎng)殖場的迫切需求，結合維生素預混料產品中維生素含量源于混合配制的原理，相關研究院所和企業(yè)[15]以理論值(或稱配方值)為定標參考值構建了12種維生素NIRS定量分析模型。該方法快速推進了不同維生素NIRS定量分析模型的構建和應用，也為混合組分指標NIRS定量分析模型的快速構建拓展了新方向。深入研究比較以檢測值為定標參考值和以理論值為定標參考值2類NIRS定量分析模型的預測精準度差異，有助于為該方法標準化奠定更堅實的理論基礎。

本試驗基于同一維生素預混料定標集，分別以檢測值、理論值為定標參考值，構建維生素E的NIRS定量分析模型，并采用同一獨立驗證集進行檢驗，比較了2類NIRS定量分析模型的預測精準度差異，并進一步分析了維生素預混料存放時間對理論值類NIRS定量分析模型預測精準度的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

共制備225個維生素預混料樣品，以稻殼粉為稀釋劑，配伍含維生素E等14種維生素成分的維生素預混料樣品，包括維生素A、維生素D3、維生素E、維生素K3、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、葉酸(維生素B9)、D-生物素(維生素B7)、煙酰胺(維生素B3)、D-泛酸(維生素B5)、維生素C磷酸酯和肌醇，并符合豬、禽和水產動物等的營養(yǎng)需求，覆蓋添加比例1%～10%。

制備后的所有樣品均真空密封包裝，存貯于4 ℃恒溫冷藏箱中。試驗開始前，取出樣品，放至室溫20～25 ℃。每個樣品取500 g，通過四分法分成2份，一份用于維生素E含量測定，另一份用于NIRS掃描。

1.2 樣本集劃分

樣本集-1(Set-1)：為比較檢測值和理論值對NIRS定量分析模型精準度的影響，選取全部制備樣品為Set-1的樣本。兼顧維生素E含量梯度，隨機選取160個樣品為定標集-1(Cal-1)樣本，剩余65個樣品為獨立驗證集-1(Val-1)樣本?；贑al-1，分別以檢測值和理論值為定標參考值，構建維生素E的NIRS定量分析模型A(Model-A)和B(Model-B)，并應用Val-1對2個模型進行獨立驗證。

樣本集-2(Set-2)：為進一步分析維生素預混料存放時間對理論值類NIRS定量分析模型預測精準度的影響，在全部制備樣品中隨機選取100個代表性樣品為Set-2的樣本，分別在室溫20～25 ℃下放置0、7和14 d時獲取樣本的NIRS。兼顧維生素E含量梯度，隨機選取80個樣品為定標集-2(Cal-2)樣本，剩余20個樣品為獨立驗證集-2(Val-2)樣本。基于Cal-2的0 d的NIRS，構建維生素E的NIRS定量分析模型C(Model-C)；基于Cal-2的0、7和14 d的NIRS，構建維生素E的NIRS定量分析模型D(Model-D)；并應用Val-2對2個模型進行獨立驗證。

1.3 定標參考值獲取

按照國家標準《飼料中維生素E的測定 高效液相色譜法》(GB/T 17812—2008)[3]中規(guī)定的方法測定，獲得樣品中維生素E檢測值。

按照原料維生素E制劑有效含量和在維生素預混料中的添加比例計算，獲得樣品中維生素E理論值。

1.4 NIRS掃描

利用配備鍍金積分球的傅里葉變換近紅外光譜儀(Bruker Matrix-Ⅰ型，德國)采集樣品的NIRS，配備高能量空氣冷卻預準直近紅外光源及硫化鉛檢測器。光譜掃描參數(shù)設置為：光譜掃描范圍10 000～4 000 cm-1，分辨率16 cm-1[16]，掃描64次取平均值，旋轉式樣品池。樣品重復裝樣掃描2次，取2次掃描的平均光譜作為樣品原始光譜。

1.5 NIRS定量分析模型的構建和篩選

模型構建：利用全譜范圍10 000～4 000 cm-1，選擇偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)方法，基于不同定標集樣本及其參考值，構建不同NIRS定量分析模型，包括Model-A、Model-B、Model-C和Model-D。采用留一交叉驗證法，根據最小交互驗證標準誤差(root mean square error of cross validation，RMSECV)原則，確定最佳主因子數(shù)。

模型篩選：基于偏最小二乘回歸模型的RMSECV指標，比較一階導數(shù)(first derivative，1D)、二階導數(shù)(second derivative，2D)、多元散射校正(multiple scattering correction，MSC)、變量標準化(standard normal variate，SNV)以及1D與MSC或SNV的組合(1D+MSC、1D+SNV)等光譜預處理方法?；谧顑?yōu)的光譜預處理方法，構建NIRS定量分析模型，用于驗證和交互評價。

1.6 預測效果評價

1.6.1 不同定標參考值的比較評價

NIRS定量分析模型的預測效果評價方法是將模型對樣本中維生素E含量的模型預測值與檢測值相比，隨后驗證線性模型(公式1)的特性[17]。公式1如下：

Y=a+bX。

(1)

式中：a為回歸截距；b為回歸系數(shù)；X為預測值；Y為檢測值。

用模型預測值與檢測值成對數(shù)據的一系列結果進行參數(shù)檢驗，確定a與0的差異及b與1的差異是否顯著。假定樣本檢測值Yi(i=1,2，…，n)服從正態(tài)分布，相互獨立且有相同方差，同時進行2個參數(shù)假設(H0：a=0且b=1，H1：H0不真)檢驗，即F-檢驗。F值計算公式如下：

(2)

(3)

(4)

若假設H0為真時，F(xiàn)～Fα(2，n-2)，其中α為置信水平，說明在一定置信水平上，a與0及b與1無顯著差異，則認為NIRS定量分析模型的預測結果完全可靠，具有較高精確度。

分析Model-A和Model-B 2個模型在不同置信水平(α=0.05和0.01)下的F-檢驗，比較2個模型的預測效果。在2個F-檢驗中，使用同一獨立驗證集Val-1樣本。

1.6.2 不同存放時間的比較評價

根據同一獨立驗證集Val-2的絕對誤差統(tǒng)計值，包括箱型圖的中位值、上四分位值和下四分位值，評價維生素預混料存放時間對理論值類NIRS定量分析模型預測精準度的影響。絕對差值為NIRS定量分析模型的預測值減去理論值。

1.7 數(shù)據統(tǒng)計分析

所有數(shù)據均采用Matlab 2008軟件(The Math Works公司，美國)配合PLS_toolbox 6.7軟件(Eigenvector Research公司，美國)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 化學成分統(tǒng)計分析

表1為不同樣本集中維生素E含量的統(tǒng)計分析。維生素E含量在2.48×104～25.54×104IU/kg(1 IU=1 mg)之間，變異系數(shù)為47%，分布較為廣泛，與市場主流維生素預混料的含量一致。Set-1的Cal-1和Val-1中維生素E檢測值的平均值、中位值、最大值、最小值和變異系數(shù)數(shù)值相近，說明具有相似的樣本分布。Set-2的Cal-2和Val-2中也具有相似的樣本分布。Cal-1中160個樣本的檢測值和理論值差異較小，這與稻殼粉及其他維生素組分中的維生素E含量極低相關。

表1 不同樣本集中維生素E含量的統(tǒng)計分析

2.2 維生素預混料NIRS特征分析

圖1為225個維生素預混料樣品的NIRS平均光譜和二階導數(shù)光譜。因維生素主要由碳、氫、氧、氮等元素構成，維生素預混料在NIRS譜區(qū)存在多處明顯吸收峰，為進行定量分析提供了良好的信息基礎。其中，4 380～4 100 cm-1區(qū)域的吸收峰主要由碳-氫(C-H)鍵伸縮振動和C-H鍵變形振動的合頻吸收引起，5 900～5 800 cm-1區(qū)域的吸收峰與C-H鍵的第一倍頻吸收相關[18-19]。但在粒度等因素影響下，10 000～5 200 cm-1波段的光譜變異明顯增大，光譜散射嚴重。

圖1 維生素預混料樣品的NIRS平均光譜和二階導數(shù)光譜

維生素E作為一種脂溶性維生素，是一種苯并二氫吡喃的衍生物，由1個β-色滿環(huán)和1個脂肪側鏈組成，存在8種異構體[20]，但預混料中使用的商品維生素E主要為人工合成的DL-α-生育酚乙酸酯，不存在同分異構體。商品維生素E一般為油劑加入適當吸附劑之后的粉劑，在NIRS譜區(qū)8 788～7 973 cm-1、7 443～6 629 cm-1和6 061～5 246 cm-1具有特征吸收峰[21]。盡管維生素預混料的載體稀釋劑影響維生素E在NIRS的特征吸收峰，但相關研究表明此影響可通過化學計量學手段降低，甚至消除[22]。

2.3 不同NIRS定量分析模型的構建和篩選

在構建NIRS定量分析模型中，本文比較了多種光譜預處理技術的效果，具體如表2所示。因為原始光譜存在散射(圖1)，所以，相較于無預處理方法，MSC方法可大幅提高4個模型的質量，決定系數(shù)(R2)提高1%～3%，RMSECV降低23%～47%。相較于無預處理方法，SNV方法也可提高4個模型的質量，但僅對Model-B的提高幅度高于MSC方法。相較于無預處理方法，1D和2D方法降低了部分模型質量，R2下降1%，RMSECV增加3%～18%。盡管導數(shù)處理具有消除光譜散射影響的能力，但也會引入噪聲，影響模型質量改善，需要平衡使用。如果將1D方法結合SNV方法和MSC方法，則也可提高模型質量，但提高幅度仍不高于MSC方法。以RMSECV最小為評價標準，Model-A、Model-B、Model-C和Model-D的最優(yōu)光譜預處理方法分別為MSC、SNV、MSC和MSC，R2分別為0.992、0.991、0.989和0.991，RMSECV分別為4.50×103、4.94×103、5.47×103和5.49×103IU/kg，相對分析誤差(ratio performance deviation，RPD)分別為11.2、10.6、9.6和10.3。RPD反映模型對預測組分總體的定標效果或預測效果，其值越大越好。如果RPD≥3，說明模型定標效果良好，可用于實際檢測。

表2 基于不同光譜預處理方法的NIRS定量分析模型

2.4 定標參考值選取的比較分析(Model-A和Model-B)

表3為基于不同定標參考值的NIRS定量分析模型比較結果。Model-A和Model-B 2個模型的F-檢驗評價結果顯示：在置信水平α=0.05下，2個模型的F值均高于F0.05(2,60)=3.15，說明2個模型均具有較高精確度，可直接用于定量分析，也說明參考值選擇檢測值和理論值的差異不大，預測散點圖如2所示；在置信水平α=0.01下，Model-A的F值5.48高于F0.01(2,60)=4.98，Model-B的F值3.77低于F0.01(2,60)=4.98，說明Model-A具有更高的精準度，也說明在此置信水平下，參考值應選擇檢測值。

表3 基于不同定標參考值的NIRS定量分析模型比較

圖2 不同NIRS定量分析模型對同一獨立驗證集的預測散點圖

2.5 不同存放時間的維生素預混料預測分析(Model-C和Model-D)

根據同一獨立驗證集Val-2的絕對誤差的統(tǒng)計值，評價分析維生素預混料存放時間對理論值類NIRS定量分析模型預測精準度的影響，如圖3所示。Model-C的預測結果顯示，同一樣本隨著存放時間由0 d增加至7、14 d，絕對誤差的中位值由0.01×104IU/kg增加至0.18×104、1.58×104IU/kg。預測值與理論值的絕對誤差逐漸朝單一方向增大，即預測值逐漸高于理論值。Model-D的預測結果顯示，同一樣本隨著存放時間由0 d增加至7、14 d，絕對誤差的中位值在0.15×104、-0.17×104和0.35×104IU/kg變動。預測值與理論值的絕對誤差未出現(xiàn)單一方向增大或減少，但其絕對值在逐漸增大，由0.15×104IU/kg增加至0.17×104、0.35×104IU/kg?？梢娀? d掃描NIRS構建的NIRS定量分析模型不適于預測存放超過7 d以上的NIRS。

圖3 不同存放時間下維生素預混料的NIRS預測絕對誤差的箱型圖

3 討 論

本研究基于同一維生素預混料的定標集，分別以檢測值、理論值為定標參考值，構建維生素E的NIRS定量分析模型，R2分別為0.992和0.991，RMSECV分別為4.50×103和4.94×103IU/kg，RPD分別為11.2和10.6。已有國內外文獻報道[11,14-15]的RMSECV多在1.3×103～11.2×103IU/kg。受載體稀釋劑類型等因素影響，維生素預混料中維生素E含量NIRS定量分析模型的精準度會略有差異[16]。本研究模型的RMSECV均在此區(qū)間，且具有較低誤差。根據F-檢驗，在置信水平α=0.05下，選擇以理論值為參考值構建維生素E的NIRS定量分析模型具有可行性。但在置信水平α=0.01下，以檢測值為參考值的維生素E定量分析模型與以理論值為參考值的維生素E定量分析模型具有差異。由此可知，在一定的檢測精準度要求下，選擇以理論值為參考值構建維生素E的NIRS定量分析模型具有可行性。尤其考慮到構建時間和成本等因素，選擇理論值作為參考值，可解決飼料廠和養(yǎng)殖場的迫切使用需求。本研究維生素預混料是以稻殼粉為載體，其中維生素E主要來源于外源添加，且配制過程中成分損失極小。這些因素降低了理論值與檢測值的差異，也成為選擇理論值為參考值的基礎條件。但鑒于飼料種類復雜，如其他添加組分中存在較高含量的維生素E，則需要進一步驗證該方法的適用性。同時，在基于理論值的NIRS定量分析模型中，維生素預混料存放7 d以上，絕對誤差的中位值增大了0.17×104IU/kg。這與維生素預混料中眾多商品維生素對熱、氧、水分和光敏感性不一基本一致[1]。盡管環(huán)境因素未顯著降低組分含量，但致使NIRS光譜產生變化，影響NIRS定量分析模型的預測。區(qū)別于濕化學方法，NIRS方法是一種經驗方法，分為定標和預測2個過程。為保障預測精準性，要求對定標和預測2個過程中的操作保持高度一致，以避免引入干擾。在構建以理論值為參考值的維生素E定量分析模型上，尤其需要考慮操作一致。本研究同時指出，NIRS獲取時間是重要的影響因素，會對模型預測結果產生較大影響。

4 結 論

① 以理論值為定標參考值構建了維生素E的NIRS定量分析模型，可解決定標參考值獲取周期長和投入大等問題，滿足飼料廠和養(yǎng)殖場在精細化生產和飼喂下的高通量篩查需求，有助于其他相似混制飼料成分指標的近紅外定量分析模型構建。

② 樣品存放時間也是影響維生素預混料NIRS定量分析模型精準度的重要因素。