黃河鯉肌肉發(fā)育關(guān)鍵因子的多克隆抗體制備及驗證

運瑩豪 宋東鎣 和子杰 米佳麗 王璐明 聶國興*

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波315211)

動物的生長主要是骨骼肌的生長，肌纖維的形成受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)家族、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)等為正向調(diào)節(jié)因子，肌細(xì)胞生長抑制素(myostatin，MSTN)等為反向調(diào)節(jié)因子[1]。在脊椎動物的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MRFs家族的4個成員，分別是肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(myogenic differentiation antigen，MyoD)、生肌因子5(myogenic factor 5，Myf5)、肌細(xì)胞生成素(myogenin，MyoG)和生肌調(diào)節(jié)因子4(myogenic regulatory factor 4，MRF4)。它們具有不同的時空表達(dá)特性，其中MyoD和Myf5主要在成肌過程的早期表達(dá)，參與成肌細(xì)胞的決定和維持；MyoG和MRF4主要參與肌細(xì)胞的終末分化過程，是骨骼肌特異性蛋白基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子[1-2]。有研究表明，魚類骨骼肌在嵌合型生長階段，MyoD、Myf5和MEF2等基因持續(xù)表達(dá)。一旦此階段基因的表達(dá)受阻，魚類個體的生長則受到抑制，致使個體變小[1,3-5]。因此，及早地激活嵌合型生長階段，對魚苗和幼魚階段的肌肉發(fā)育和個體體重的增加極為重要。

有研究發(fā)現(xiàn)配對盒轉(zhuǎn)錄因子3(paired box 3，Pax3)和配對盒轉(zhuǎn)錄因子7(paired box 7，Pax7)的高表達(dá)是肌衛(wèi)星細(xì)胞的特異性標(biāo)志，同時，它們在肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用，Pax7被作為體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定基因[6]。Pax3和Pax7作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)節(jié)生肌調(diào)節(jié)因子Myf5和MyoD的表達(dá)，繼而影響肌細(xì)胞分化。通過基因表達(dá)和細(xì)胞定位研究揭示，肌衛(wèi)星細(xì)胞通過非對稱性細(xì)胞分裂來維持生肌細(xì)胞的激活和自我更新，即一部分來自肌衛(wèi)星分裂的子細(xì)胞維持著干細(xì)胞功能，而另一些子細(xì)胞則被激活形成肌細(xì)胞進(jìn)而發(fā)育成肌纖維[1,7]。

然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物關(guān)于肌源性生長轉(zhuǎn)錄因子在蛋白質(zhì)水平的檢測相對較少，大部分局限于轉(zhuǎn)錄水平的檢測，這種局限性制約了水產(chǎn)動物肌肉發(fā)育調(diào)控更深入的研究。因此，本研究以黃河鯉白肌為原材料，通過原核表達(dá)技術(shù)獲得重要的含有抗原決定簇的4種肌肉發(fā)育的關(guān)鍵因子(Pax7、MyoD、MyoG和MRF4)的融合蛋白，經(jīng)過純化之后免疫新西蘭大耳兔(Oryctolaguscuniculus)，獲得相應(yīng)的鯉多克隆抗體，并以此為工具，檢測黃河鯉白肌組織中Pax7、MyoD、MyoG和MRF4在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，為探究黃河鯉肌肉發(fā)育的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新西蘭大耳兔購自河南省新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，pMD 19-T Vector(Code No.6013)購自寶生物工程(大連)有限公司，pET21a(+) Vector、DH5α和BL211(DE3)受體菌為本實驗室保存。

1.2 鯉肌肉總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

無菌條件下取300～500 mg黃河鯉肌肉組織，Trizol法提取樣品總RNA，總RNA質(zhì)量及濃度用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美國)測定，以206和280 nm處吸光度值的比值為1.80～2.10作為RNA質(zhì)量和純度的標(biāo)準(zhǔn)，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA質(zhì)量進(jìn)行定性檢驗。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書獲得第1鏈cDNA。

1.3 含抗原決定簇基因片段的工程菌的構(gòu)建

1.3.1 目的基因引物設(shè)計

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫查閱黃河鯉肌肉發(fā)育關(guān)鍵基因Pax7、MyoD、MyoG和MRF4的序列全長，將開放閱讀框(ORF)翻譯成為蛋白質(zhì)序列，利用DNAstar軟件的Lasergene程序中protean子程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的抗原決定簇預(yù)測分析。采用Primer 5.0分別設(shè)計上述基因的特異性引物，分析并添加特定的酶切位點。表達(dá)載體為pET21a(+)，感受態(tài)細(xì)胞為BL21(DE3)，基因的引物序列及相關(guān)信息如表1所示。

表1 原核表達(dá)相關(guān)基因的引物序列及相關(guān)信息

1.3.2 目的基因的PCR擴(kuò)增

使用2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系包括2×Phanta Max Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，共20 μL。試劑混勻后迅速離心，PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃ 3 min，預(yù)變性；95 ℃ 30 s，變性，55 ℃ 15 s，復(fù)性，72 ℃ 30 s，延伸，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min和12 ℃暫存(暫存時間不超過30 min，PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后及時取出反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行下一步試驗)。

1.3.3 目的片段的膠回收

采用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(CW2302A，江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)回收凝膠中的DNA目的片段。

1.3.4 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收的目的片段連接到pMD19-T克隆載體上。反應(yīng)體系包括2×Solution I 5 μL，目的基因4.5 μL，pMD19-T Vector 0.5 μL，共10 μL。混勻后迅速離心，置于PCR儀中，16 ℃過夜進(jìn)行T-A連接。

1.3.5 重組克隆質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選

采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α內(nèi)。選取陽性克隆，將其菌液逐級培養(yǎng)，用30%甘油溶液于-80 ℃保存。提取陽性克隆質(zhì)粒，一部分質(zhì)粒于-80 ℃保存，一部分質(zhì)粒則送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.3.6 重組質(zhì)粒DNA的提取

采用質(zhì)粒抽提試劑盒(D6943-02，OMEGA，美國)按照說明書提取質(zhì)粒DNA。

1.3.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及篩選

1.3.7.1 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切

將陽性重組克隆質(zhì)粒pMD-19T-Pax7、pMD-19T-MyoD、pMD-19T-MyoG和pMD-19T-MRF4進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為重組質(zhì)粒(recombinant plasmid) 5 μL，10×Buffer 5 μL，BamH Ⅰ 2 μL，Hind Ⅲ 2 μL，ddH2O 36 μL，共50 μL。37 ℃水浴孵育過夜，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切位點的黃河鯉Pax7、MyoD、MyoG和MRF4片段并回收。利用上述步驟進(jìn)行表達(dá)載體pET21a(+)的雙酶切及產(chǎn)物純化回收。

1.3.7.2 目的片段與表達(dá)載體的連接

將含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切位點的黃河鯉Pax7、MyoD、MyoG和MRF4片段與表達(dá)載體pET21a(+)的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。反應(yīng)體系為2×T4 Buffer 5 μL，雙酶切基因片段3 μL，pET21a(+) 1 μL，T4 Ligase 1 μL，共10 μL?；靹蚝笱杆匐x心，置于PCR儀，16 ℃過夜進(jìn)行T4連接。

1.3.7.3 T4連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、篩選及陽性重組表達(dá)質(zhì)粒的提取

將T4連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pGEM-T感受態(tài)中，隨后進(jìn)行篩選和陽性重組表達(dá)質(zhì)粒的提取。

1.3.8 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切驗證

用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-Pax7、pET-21a-MyoD、pET-21a-MyoG和pET-21a-MRF4進(jìn)行雙單酶切驗證，方法與重組克隆質(zhì)粒雙酶切相同。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，采集并分析電泳圖像。將一部分篩選得到的陽性克隆質(zhì)粒于-20 ℃保存?zhèn)溆?，一部分送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.4 重組蛋白的原核表達(dá)

1.4.1 表達(dá)菌株的制備

將1.3中構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-Pax7、pET-21a-MyoD、pET-21a-MyoG和pET-21a-MRF4通過熱激轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)大腸桿菌BL21中，并篩選陽性克隆。將獲得的陽性克隆接種于LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100 μg/mL)，37 ℃下200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。

1.4.2 目的重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

無菌條件下，取培養(yǎng)過夜的菌液5 mL加入到250 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃下200 r/min振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，至菌液600 nm處吸光度值達(dá)到0.5～0.6時(2.5～3.0 h)，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo)劑，37 ℃下200 r/min振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，期間每小時分別取菌液1 mL，用于后續(xù)蛋白表達(dá)的驗證。

1.4.3 目的重組蛋白的檢測

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)的方法檢測原核表達(dá)的融合蛋白，以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體作為對照。

1.4.4 重組蛋白的純化

經(jīng)SDS-PAGE檢測到目的蛋白表達(dá)后，采用1 mL鎳離子預(yù)裝柱(HisTrapTMexcel)對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化。室溫條件下8 000×g離心2 min，收集菌體，將收集到的菌體用平衡緩沖液[equilibration buffer，20 mmol/L磷酸(PB)緩沖液，500 mmol/L NaCl溶液，pH 7.4]重懸浮，重懸浮的菌體在冰浴中進(jìn)行超聲波裂解(6 mm變幅桿，35%功率，3.5 s工作，7 s休息，裂解60～120 min，至溶液由渾濁變清透，由黏稠變不黏稠表明裂解完成)。裂解后獲得目的重組蛋白，借助清洗緩沖液(wash buffer，20 mmol/L PB緩沖液，500 mmol/L NaCl溶液，20 mmol/L咪唑，pH 7.4)和洗脫緩沖液(elution buffer，20 mmol/L PB緩沖液，500 mmol/L NaCl溶液，250 mmol/L咪唑，pH 7.4)對重組蛋白進(jìn)行純化。將收集到的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測分析，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。用透析方法最大限度去除純化后重組蛋白溶液中的尿素和咪唑等離子。

1.5 多克隆抗體的制備

1.5.1 重組蛋白免疫動物

將分裝的1 mL重組蛋白(約300 μg/mL)+1 mL完全弗氏佐劑/不完全弗氏佐劑，用破碎儀充分混勻，檢查乳化程度(將乳化好的重組蛋白溶液滴在水面上，如果液滴不擴(kuò)散，表明重組蛋白和佐劑已達(dá)到“油包水”的完全乳化狀態(tài))。采用耳緣靜脈注射和多點皮下注射的方法免疫新西蘭大耳兔[8]，每周免疫1次，共計免疫5次，初次免疫用的乳化劑為完全弗氏佐劑，后續(xù)的乳化劑為不完全弗氏佐劑。

1.5.2 兔源多克隆抗體效價的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的方法檢測新西蘭大耳兔血清中抗體的效價。重組蛋白最后1次免疫新西蘭大耳兔前1周進(jìn)行耳緣靜脈采血，將純化的重組蛋白用包被液稀釋至10 μg/mL，向酶標(biāo)板中加入抗原100 μL/孔，4 ℃過夜包被。使用封閉液[10 g脫脂奶粉溶于100 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液]37 ℃孵育2 h后用抗體稀釋液對兔源血清進(jìn)行倍比稀釋(稀釋倍數(shù)：100、1 000、10 000、30 000、90 000、270 000、810 000、2 430 000)，向酶標(biāo)板中依次加入100 μL/孔的稀釋血清，37 ℃孵育2 h，以未免疫的兔源血清為對照組。用抗體稀釋液按1∶20 000的比例稀釋羊抗兔二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(H+L)[HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG (H+L)]，向酶標(biāo)板中依次加入100 μL/孔的稀釋二抗，37 ℃孵育1 h。加入100 μL/孔的顯色液，37 ℃孵育30 min，終止液為2 mol/L H2SO4溶液，每孔加入50 μL，在酶標(biāo)儀中讀取450 nm處的吸光度值，統(tǒng)計結(jié)果。

抗體效價判定標(biāo)準(zhǔn)：試驗組與陰性對照組的吸光度值比值應(yīng)≥2，血清的最大稀釋倍數(shù)為待測抗體的效價。抗體效價檢測達(dá)標(biāo)后，通過頸動脈插管取血，以獲得免疫血清，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 黃河鯉肌肉組織免疫熒光驗證

隨機(jī)選取3尾黃河鯉(n=3)，從其背鰭前下方側(cè)線以上區(qū)域取5 mm×5 mm×5 mm大小的肌肉組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中固定，然后經(jīng)過梯度酒精脫水后使用石蠟包埋，對包埋好的肌肉組織塊進(jìn)行切片，每個多克隆抗體在3尾黃河鯉肌肉組織塊的6個平行切片樣品上進(jìn)行驗證，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水后，使用H2O2(8 mL甲醇+1 mL PBS緩沖液+1 mL 30 % H2O2)封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，再使用山羊血清(北京索萊寶科技有限公司)封閉后，分別使用抗Pax7、MyoD、MyoG和MRF4血清4 ℃孵育過夜，第2天使用熒光二抗HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG (H+L)孵育，再使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，最后用抗熒光淬滅劑封片，透明指甲油封邊。使用熒光顯微鏡對切片進(jìn)行拍照，使用Image J對圖片熒光面積進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃河鯉肌肉發(fā)育關(guān)鍵基因抗原決定簇片段的克隆

以黃河鯉肌肉的cDNA為模板，以1.3.1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Pax7、MyoD、MyoG和MRF4基因的全長序列。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，分別在360、370、390和440 bp附近獲得1條特異性的條帶(圖1)，實際大小為364、373、388和442 bp，大小與預(yù)期一致。

Pax7：配對盒轉(zhuǎn)錄因子7 paired box 7；MyoD：肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 myogenic differentiation antigen；MyoG：肌細(xì)胞生成素 myogenin；MRF4：生肌調(diào)節(jié)因子4 myogenic regulatory factor 4。下圖同 the same as below。

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切驗證

將Pax7、MyoD、MyoG和MRF4片段瓊脂糖凝膠純化后的酶切片段與pET-21a(+)質(zhì)粒瓊脂糖凝膠純化后的酶切產(chǎn)物進(jìn)行T4鏈接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)。

對篩選獲得的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)雙酶切(BamH Ⅰ和Hind Ⅲ)處理(圖2)，檢測Pax7、MyoD、MyoG和MRF4目的片段是否連接到表達(dá)載體pET-21a(+)上。酶切反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果(圖2)。1號和2號泳道分別為重組質(zhì)粒和雙酶切片段。根據(jù)酶切結(jié)果可知pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)均為陽性重組表達(dá)質(zhì)粒。

M:D2000 bp DNA ladder；1:重組質(zhì)粒；2:重組質(zhì)粒雙酶切片段。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的測序鑒定

初步的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測序檢測，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已提交的基因進(jìn)行序列比對，序列同源性均在99 %以上，說明表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)中所插入的基因片段均為目的片段。

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定

2.4.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并選用無IPTG誘導(dǎo)的含有重組表達(dá)質(zhì)粒的菌液做陰性對照。重組蛋白電泳結(jié)果顯示：IPTG誘導(dǎo)后，重組表達(dá)質(zhì)粒的菌液所在泳道均具有特異性蛋白條帶，大小分別約16、17、17和19 ku(圖3)(實際大小分別為15.60、16.90、16.91和19.35 ku)，而陰性對照在此位置沒有特異性蛋白條帶。

M:蛋白質(zhì)marker (11～245 ku)；0：重組質(zhì)粒無IPTG誘導(dǎo)組；1：重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)組。

2.4.2 目的蛋白的純化

收集表達(dá)重組目的蛋白菌體，超聲破碎后經(jīng)鎳離子柱純化、半透膜透析和超濾等技術(shù)得到純化后的重組目的蛋白。PBS或未誘導(dǎo)的含有重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體做陰性對照(0號泳道)和純化的目的蛋白溶液(1號泳道)經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4所示。

M:蛋白質(zhì)marker (11～245 ku)；0：陰性對照組；1：重組蛋白純化組；

2.5 多克隆抗體效價

采用ELISA的方法檢測收集的血清中多克隆抗體的效價，結(jié)果如表2、表3、表4、表5所示。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ列為試驗組的3個平行數(shù)據(jù)，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ列為對照組(未免疫兔血清)的3個平行數(shù)據(jù)。從表中可以看出，當(dāng)兔源血清稀釋至2.43×106時，4種多克隆抗體的試驗組與對照組的效價比值均大于2，故判定制備的4種多克隆抗體的效價均達(dá)到2.4×106。

表2 ELISA方法測定多克隆抗體Pax7效價

表3 ELISA方法測定多克隆抗體MyoD效價

表4 ELISA測定多克隆抗體MyoG效價

表5 ELISA方法測定多克隆抗體MRF4效價

2.6 黃河鯉白肌中肌肉發(fā)育關(guān)鍵因子的蛋白免疫熒光檢測

鯉肌肉中肌肉發(fā)育關(guān)鍵因子的蛋白免疫熒光檢測及對比如圖5、圖6所示。數(shù)據(jù)分析顯示，黃河鯉白肌中Pax7、MyoD、MyoG和MRF4蛋白免疫熒光信號強(qiáng)度無顯著差異(n=3,P>0.05)。

FITC:經(jīng)異硫氰酸熒光素染色后的肌纖維橫截面；DAPI:經(jīng)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色細(xì)胞核的肌纖維橫截面；Merge:將2個圖進(jìn)行合并后的肌纖維橫截面。

圖6 黃河鯉白肌中肌肉發(fā)育關(guān)鍵因子的

3 討 論

本試驗采用常規(guī)的多克隆抗體的制備方法，利用生物信息學(xué)方法從NCBI數(shù)據(jù)庫和國家生物信息中心(China National Center for Bioinformation，CNCB)搜集鯉的相關(guān)蛋白分子信息，經(jīng)過分析Pax7、MyoD、Myogenin和MRF4 4個蛋白因子的分子序列特征，采用Protean、Primer 5.0、DNAMAN等軟件分析各個蛋白的抗原決定簇序列，經(jīng)過基因克隆和蛋白表達(dá)試驗，獲得相應(yīng)的融合蛋白，經(jīng)過鎳離子親和層析柱的純化，透析和超濾富集，獲得高濃度的融合蛋白。在融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的過程中，由于使用大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)，個別融合蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)，需要用高濃度的尿素溶液溶解，在后續(xù)的純化過程中，增加了融合蛋白變性的風(fēng)險，盡管有些融合蛋白發(fā)生變性而沉淀，在后續(xù)的免疫過程中并不影響多克隆抗體的制備。但是，相關(guān)蛋白的細(xì)胞孵育試驗的功能驗證無法進(jìn)行，因此需要優(yōu)化純化和透析的試驗步驟或使用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的表達(dá)，減小融合蛋白以包涵體形式出現(xiàn)的幾率。

本研究中，黃河鯉白肌中Pax7、MyoD、MyoG和MRF4蛋白免疫熒光信號強(qiáng)度無顯著差異，黃河鯉白肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞的維持、激活和復(fù)制過程與成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞、單核成肌細(xì)胞融合為多核成肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞分化融合為肌管過程同步進(jìn)行，肌纖維正常形成，即白肌中肌纖維的增生與增粗同時存在。本試驗所選用的4個蛋白因子是肌肉發(fā)育的不同階段的關(guān)鍵標(biāo)志性蛋白，具有不同的時空表達(dá)特性。在哺乳動物中，出生后的肌纖維數(shù)目幾乎是固定的，生長主要依靠肌纖維的增粗[9]，增生對其生長的作用極小，僅發(fā)現(xiàn)在肌肉損傷后的生長中有新的肌纖維產(chǎn)生[10]，導(dǎo)致其存在有限的生長和固定的體型，屬于限定增長。魚類骨骼肌的生長調(diào)控是多樣的，大多數(shù)魚類骨骼肌的生長是非限定增長，出膜后的肌纖維數(shù)量不是固定的，在生命周期中涉及肌纖維的增生與增粗[11]，2種肌纖維的生長模式共同作用促進(jìn)骨骼肌的持續(xù)生長。Pax7作為肌衛(wèi)星細(xì)胞的特異性標(biāo)志[12-13]，用來鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞是否成功分離純化。用cRNA探針進(jìn)行原位雜交試驗，證實了Pax7在單核肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá)[14]。在胚后的生長發(fā)育中，肌衛(wèi)星細(xì)胞的維持、激活、復(fù)制過程都呈現(xiàn)出Pax7的高表達(dá)[15]。Pax7的表達(dá)缺失時，機(jī)體會阻滯細(xì)胞周期和早熟分化，從而導(dǎo)致肌肉分化的缺陷[16-17]。MyoD可促使非成肌細(xì)胞向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步促進(jìn)肌細(xì)胞融合、分化為成熟的肌纖維；當(dāng)MyoD表達(dá)缺失時，肌細(xì)胞的增殖和分化將無法進(jìn)行。MyoG可以終止肌細(xì)胞的增殖，同時促使單核成肌細(xì)胞向多核肌細(xì)胞融合；當(dāng)MyoG表達(dá)缺失時，成肌細(xì)胞則停止分裂與增殖，致使肌肉發(fā)育受阻[18]。MRF4可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化融合成為肌管，并促進(jìn)肌纖維的形成，同時也可維持肌細(xì)胞的穩(wěn)定[19]，與MyoG共同控制肌肉的分化過程；當(dāng)MRF4表達(dá)缺失時，小鼠的骨骼肌雖然形成，但卻因為肋骨存在生長缺陷，在出生后即死亡[20]。

本試驗成功制備了兔源性黃河鯉4個肌肉發(fā)育不同階段的關(guān)鍵標(biāo)志性蛋白(Pax7、MyoD、Myogenin和MRF4)的多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測，4種抗體的效價均達(dá)到2.4×106以上，這與本實驗室制備的鯉的營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運載體和細(xì)胞因子的多克隆抗體的效價相似[8,21-22]，該結(jié)果初步表明所得的抗體可以滿足后續(xù)的分析。以本研究制備的多克隆抗體為一抗，用組織免疫熒光的方法檢測并驗證其在黃河鯉白肌組織石蠟切片的應(yīng)用效果及穩(wěn)定性，結(jié)果表明4種抗體可以用于黃河鯉白肌組織的相應(yīng)的蛋白定量表達(dá)檢測，且特異性、穩(wěn)定性和親和性均較高。

4 結(jié) 論

綜上所述，本試驗制備的穩(wěn)定性及特異性較高的黃河鯉肌肉發(fā)育關(guān)鍵因子的多克隆抗體可以滿足鯉肌肉發(fā)育過程中相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測和驗證，可為水產(chǎn)動物骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究提供有力的工具。