β-胡蘿卜素對(duì)母兔生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、生殖激素指標(biāo)及卵泡發(fā)育的影響

孫 磊 魏宇超 劉福鑫 陳寶江, 王志剛

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，保定071000)

β-胡蘿卜素(β-carotene)是類胡蘿卜素的一種，主要分布于植物和細(xì)菌體內(nèi)的光合作用器官中，動(dòng)物體內(nèi)不能合成，是維生素A的前體物質(zhì)，具有與維生素A相似的生理功能，能夠預(yù)防維生素A缺乏所導(dǎo)致的疾病。動(dòng)物體內(nèi)β-胡蘿卜素可以保護(hù)子宮、卵巢及活性生殖細(xì)胞免受氧化反應(yīng)的破壞，增強(qiáng)動(dòng)物的繁殖能力，提高生長(zhǎng)性能。β-胡蘿卜素還是黃體細(xì)胞微粒體膜的組成成分，可刺激黃體細(xì)胞合成孕酮(PROG)而維持妊娠，提高子宮、卵巢生殖細(xì)胞活性，減少胚胎死亡和早期流產(chǎn)[1]。葛金山等[2]在母豬基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg/kg β-胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)母豬的窩產(chǎn)活仔數(shù)和出生窩重均顯著提高。馮俊等[3]在妊娠后期母豬飼糧中添加160 mg/kg微囊化β-胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)仔豬初生重和初生窩重均顯著提高，但對(duì)產(chǎn)活仔數(shù)無(wú)顯著影響。李梓妍等[4]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛產(chǎn)后飼糧中添加β-胡蘿卜素能縮短產(chǎn)后首次發(fā)情時(shí)間，減少配種次數(shù)，提高受胎率，降低生殖疾病的發(fā)生。Brief等[5]給配種后期母豬注射12 300 IU維生素A和32.6 mg β-胡蘿卜素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)母豬血清中維生素A、β-胡蘿卜素含量顯著提高，早期胚胎死亡率顯著降低，窩產(chǎn)活仔數(shù)、初生窩重、斷奶活仔數(shù)和斷奶窩重均顯著提高。梁寧[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加復(fù)方β-胡蘿卜素能夠顯著提高母豬繁殖性能，并且在每個(gè)繁殖階段起到了不同的作用。

目前關(guān)于飼糧中添加β-胡蘿卜素的研究主要集中于豬和反芻動(dòng)物，家兔是一種繁殖力更強(qiáng)的小型草食動(dòng)物，對(duì)與繁殖相關(guān)營(yíng)養(yǎng)素需要更多，但有關(guān)家兔飼糧中添加β-胡蘿卜素的報(bào)道極少。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)母兔生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、生殖激素指標(biāo)及卵泡發(fā)育的影響，為β-胡蘿卜素在家兔生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物試驗(yàn)于2020年12月至2021年3月于河北省保定市唐縣北羅鎮(zhèn)華益兔業(yè)養(yǎng)殖基地進(jìn)行。選取55～60日齡、體重[(1.679±0.114) kg]相近、健康狀態(tài)良好的伊拉父母代母兔160只，隨機(jī)分為4組，每組20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加15、30、45 mg/kg β-胡蘿卜素。預(yù)試期7 d，正試期84 d。整個(gè)試驗(yàn)期母兔自由采食和飲水。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧以玉米、小麥麩、豆粕為主要原料，參照谷子林等[7]推薦的兔營(yíng)養(yǎng)需要配制，制成直徑×長(zhǎng)度為4 mm×10 mm的顆粒料?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

分別于試驗(yàn)第70和84天，每組隨機(jī)選取6只母兔進(jìn)行血液采集，并分離血清樣品，-20 ℃保存，用于測(cè)定血清抗氧化和激素指標(biāo)。試驗(yàn)第84天，每組隨機(jī)選取6只母兔進(jìn)行屠宰，取右側(cè)卵巢樣品于5 mL凍存管中，-80 ℃保存，用于測(cè)定卵巢抗氧化和激素指標(biāo)。另取左側(cè)卵巢樣品，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后，放入10%多聚甲醛溶液中，用于測(cè)量卵巢組織形態(tài)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期開始和結(jié)束時(shí)，以重復(fù)為單位稱量各組母兔的體重，獲得初始體重和終末體重，計(jì)算總增重以及平均日增重(ADG)；試驗(yàn)期間記錄各組母兔每天采食量，計(jì)算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。計(jì)算公式如下：

總增重=終末體重-初始體重；
ADG=(終末體重-初始體重)/試驗(yàn)天數(shù)；
ADFI=(投料量-余料量)/(試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×
試驗(yàn)天數(shù))；
F/G=總采食量/總增重。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)

測(cè)定血清以及組織勻漿后的卵巢樣品中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法進(jìn)行檢測(cè)，ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，參照內(nèi)置說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 激素指標(biāo)

測(cè)定血清以及組織勻漿后的卵巢樣品中促黃體素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、PROG含量。利用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，參照內(nèi)置說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 卵巢組織形態(tài)

固定組織經(jīng)脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片后采用匈牙利3DHISTECH公司生產(chǎn)的Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，采用麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的Panthera數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部組織，觀察大體病變，采集40倍和200倍圖片，并計(jì)算初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡和黃體比例。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行整理和初步計(jì)算，再利用SPSS 25.0一般線性模型(GLM)進(jìn)行多因素方差分析。單個(gè)因素間的比較則利用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。統(tǒng)計(jì)模型中包括添加水平、時(shí)間和添加水平×?xí)r間。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 β-胡蘿卜素對(duì)母兔生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)母兔的終末體重、總增重、ADG、ADFI以及F/G均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 β-胡蘿卜素對(duì)母兔生長(zhǎng)性能的影響

2.2 β-蘿卜素對(duì)母兔抗氧化功能的影響

2.2.1 β-蘿卜素對(duì)母兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)血清中SOD活性有顯著影響(P<0.05)，對(duì)血清中GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC沒有顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加45 mg/kg β-胡蘿卜素顯著降低了血清中SOD活性(P<0.05)。時(shí)間對(duì)母兔血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC有顯著影響(P<0.05)，對(duì)血清中MDA含量沒有顯著影響(P>0.05)。隨著時(shí)間的增加，母兔血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC顯著升高(P<0.05)。添加水平和時(shí)間的互作效應(yīng)對(duì)母兔血清中SOD活性有顯著影響(P<0.05)，對(duì)血清中GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC沒有顯著影響(P>0.05)。

表3 β-胡蘿卜素對(duì)母兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.2 β-胡蘿卜素對(duì)母兔卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)卵巢中SOD、GSH-Px活性和MDA含量以及T-AOC均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 β-胡蘿卜素對(duì)母兔卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 β-胡蘿卜素對(duì)母兔生殖激素指標(biāo)的影響

2.3.1 β-胡蘿卜素對(duì)母兔血清生殖激素指標(biāo)的影響

由表5可知，第70天時(shí)，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)血清中LH和E2含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)；與對(duì)照組相比，飼糧中添加30 mg/kg β-胡蘿卜素顯著降低了血清中FSH和PROG含量(P<0.05)。第84天時(shí)，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)血清中LH、FSH、E2和PROG含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表5 β-胡蘿卜素對(duì)母兔血清生殖激素指標(biāo)的影響

2.3.2 β-胡蘿卜素對(duì)母兔卵巢生殖激素指標(biāo)的影響

由表6可知，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)卵巢中LH和FSH含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加30 mg/kg β-胡蘿卜素顯著提高了卵巢中E2含量(P<0.05)；45 mg/kg β-胡蘿卜素組卵巢中E2含量顯著低于15和30 mg/kg β-胡蘿卜素組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加15 mg/kg β-胡蘿卜素顯著降低了卵巢中PROG含量(P<0.05)；15 mg/kg β-胡蘿卜素組卵巢中PROG含量顯著低于30 mg/kg β-胡蘿卜素組(P<0.05)。

2.4 β-胡蘿卜素對(duì)母兔卵泡發(fā)育的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加β-胡蘿卜素提高了母兔初級(jí)卵泡比例，其中45 mg/kg β-胡蘿卜素組達(dá)到顯著水平(P<0.05)；飼糧中添加β-胡蘿卜素降低了閉鎖卵泡比例(P>0.05)，提高了成熟卵泡和黃體比例(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 β-胡蘿卜素對(duì)母兔生長(zhǎng)性能的影響

β-胡蘿卜素是由植物自身合成的維生素A的前體物質(zhì)，具有特定生物活性功能。賈福昌等[8]研究表明，在維生素A水平相同的情況下，飼糧中額外添加40 mg/kg β-胡蘿卜組可以提高6周齡新西蘭兔增長(zhǎng)速度，降低F/G。馬誠(chéng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，給7周齡Wistar大鼠添加10 mg/(kg·d) β-胡蘿卜素，對(duì)其體重和生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著影響。褚千然等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雛雞飼糧中添加β-胡蘿卜素對(duì)21日齡體重及脛骨長(zhǎng)度無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)中，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對(duì)母兔生長(zhǎng)性能沒有顯著影響，其原因可能是本試驗(yàn)所添加的β-胡蘿卜素主要發(fā)揮了維生素A前體作用，但具體機(jī)理有待研究。

3.2 β-蘿卜素對(duì)母兔抗氧化能力的影響

機(jī)體內(nèi)抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，主要包括SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶(CAT)等，可以抑制體內(nèi)自由基的生成并且清除體內(nèi)多余的自由基。β-胡蘿卜素具是一種良好的抗氧化劑，能夠減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物的產(chǎn)生，緩解氧化應(yīng)激帶來(lái)的病癥[11]。β-胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)含有多個(gè)共軛雙鍵，能夠捕捉、淬滅自由基和單線態(tài)氧，減少自由基對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷[12-13]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加15 mg/kg β-胡蘿卜素可以提高母兔血清中SOD活性，與任延利等[14]、張相倫等[15]、馬誠(chéng)等[9]研究結(jié)果一致。這是由于β-胡蘿卜素是一類非酶抗氧化物質(zhì)，可以上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)mRNA相對(duì)表達(dá)量，激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)-Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路，進(jìn)而增加抗氧化酶基因的表達(dá)量，推動(dòng)抗氧化酶發(fā)揮作用[16-18]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)添加低劑量β-胡蘿卜素有提高母兔血清和卵巢組織中SOD活性的趨勢(shì)，說(shuō)明β-胡蘿卜素可以提高卵巢組織的抗氧化能力，保護(hù)卵泡細(xì)胞完整性，進(jìn)而加快卵泡發(fā)育以及生殖激素分泌。

有研究表明，機(jī)體抗氧化能力與β-胡蘿卜素添加水平呈非線性相關(guān)，β-胡蘿卜素添加水平并非越高越好，過(guò)量的添加β-胡蘿卜素同樣會(huì)造成機(jī)體抗氧化功能的降低甚至喪失[19]。Khopde等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高添加水平的β-胡蘿卜素未表現(xiàn)抗氧化作用。梁惠等[21]研究表明，補(bǔ)充15.0 mg/(kg·d)β-胡蘿卜素對(duì)成年Wistar大鼠DNA損傷無(wú)明顯防護(hù)作用，而補(bǔ)充4.28 mg/(kg·d)β-胡蘿卜素則可發(fā)揮較好的抗氧化和降低烷化損傷效果。這說(shuō)明高水平β-胡蘿卜素對(duì)機(jī)體抗氧化產(chǎn)生了負(fù)面影響。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，飼糧中添加45 mg/kg β-胡蘿卜素會(huì)導(dǎo)致母兔血清中SOD活性顯著降低。同時(shí)，45 mg/kg β-胡蘿卜素組卵巢組織中SOD活性和T-AOC低于30 mg/kg β-胡蘿卜素組。這說(shuō)明母兔飼糧中過(guò)量添加β-胡蘿卜素可能導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.3 β-蘿卜素對(duì)母兔繁殖激素指標(biāo)的影響

動(dòng)物的生殖活動(dòng)受生殖激素的調(diào)控，一般認(rèn)為，血清LH、FSH、E2以及PROG含量可以反映體內(nèi)生殖激素情況，進(jìn)而反映動(dòng)物繁殖能力的高低。FSH與LH共同作用促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，分泌E2并排卵。E2能抑制FSH的合成和釋放，與少量PROG協(xié)同促進(jìn)LH的釋放，維持黃體功能。PROG與E2共同作用，抑制FSH和LH的分泌，促使母畜發(fā)情[22]。β-胡蘿卜素是黃體的固有成分，可以進(jìn)入卵泡，調(diào)節(jié)激素分泌[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素通過(guò)提高吻素1(Kiss1)/G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)途徑，提高垂體中LH-β表達(dá)，促進(jìn)LH分泌[24]。如Schweigert等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在青年母豬飼糧中添加β-胡蘿卜素(100 mg/kg)+維生素A(4 000 IU/kg)，直接影響了母豬卵巢類固醇激素的分泌，也可刺激黃體細(xì)胞分泌PROG；劉銳鋼等[26]在妊娠后期母豬飼糧中添加160 mg/kg微囊化β-胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)母豬妊娠第110天血清中E2和PROG含量顯著提高；李梓妍[27]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)后荷斯坦奶牛飼糧中添加β-胡蘿卜素有升高血清中PROG含量的趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加30 mg/kg β-胡蘿卜素可以顯著提高母兔卵巢組織中E2含量，說(shuō)明此劑量的β-胡蘿卜素可能在母兔卵巢中發(fā)揮了積極作用。這可能與β-胡蘿卜素作為黃體細(xì)胞的組成成分，可以促進(jìn)雌性動(dòng)物黃體分泌雌激素，進(jìn)而促進(jìn)PROG分泌有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，缺乏β-胡蘿卜素而導(dǎo)致的黃體細(xì)胞PROG分泌減少的現(xiàn)象能通過(guò)補(bǔ)充β-胡蘿卜素而得到改善[28-30]。另外，β-胡蘿卜素的抗氧化特性能使卵泡細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞免受自由基的損害，從而促進(jìn)生殖激素的分泌。與上述結(jié)果不同的是，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，飼糧中添加30 mg/kg β-胡蘿卜素顯著降低了70 d血清中FSH和PROG含量，可能是由于血清中LH含量升高，影響了FSH的分泌，導(dǎo)致血清FSH含量降低[22]。值得注意的是，45 mg/kg β-胡蘿卜素組母兔卵巢中FSH、E2以及PROG含量均低于30 mg/kg β-胡蘿卜素組，可能是由于β-胡蘿卜素添加水平過(guò)高導(dǎo)致的副作用，這與本試驗(yàn)抗氧化指標(biāo)結(jié)果一致。但關(guān)于家兔飼糧中β-胡蘿卜素的最高添加水平還沒有相關(guān)報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。

3.4 β-胡蘿卜素對(duì)母兔卵泡發(fā)育的影響

在卵泡發(fā)育過(guò)程中，垂體分泌的促性腺激素(FSH和LH)起著重要作用，它可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、卵泡細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)卵泡排卵、黃體生成。原始卵泡發(fā)育成初級(jí)卵泡與促性腺激素關(guān)系不大，是一種局部作用。卵泡生長(zhǎng)到4層顆粒細(xì)胞之后，一般才開始依靠生殖激素作用，生殖激素與卵巢顆粒細(xì)胞上的受體結(jié)合后啟動(dòng)發(fā)情，加快卵泡發(fā)育，提高卵泡質(zhì)量[31-32]。β-胡蘿卜素良好的抗氧化能力保護(hù)了卵巢細(xì)胞的完整性，促進(jìn)卵泡發(fā)育。β-胡蘿卜素還可以進(jìn)入卵泡，調(diào)節(jié)激素分泌，進(jìn)而加快卵泡發(fā)育。Meza-Herrera等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊飼糧中添加β-胡蘿卜素可以促進(jìn)卵泡發(fā)育。楊旭[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-胡蘿卜素能夠提高奶牛發(fā)情表現(xiàn)，促進(jìn)卵泡發(fā)育及成熟，提高受胎率，減少受配次數(shù)。李超[35]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-胡蘿卜素可促進(jìn)產(chǎn)后奶牛子宮恢復(fù)和卵泡發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-胡蘿卜素對(duì)母兔初級(jí)卵泡發(fā)育有促進(jìn)作用，同時(shí)有降低母兔閉鎖卵泡比例的趨勢(shì)，與上述結(jié)果大體一致。這說(shuō)明飼糧中添加β-胡蘿卜素可以通過(guò)其良好的抗氧化能力，保護(hù)卵巢免受自由基損害，促進(jìn)初級(jí)卵泡發(fā)育；β-胡蘿卜素在卵泡內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)體FSH和LH分泌，減少了卵泡閉鎖比例，從而對(duì)卵泡發(fā)育起到正向作用。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加15、30 mg/kg β-胡蘿卜素可以改善母兔的抗氧化能力，添加45 mg/kg β-胡蘿卜素則會(huì)降低母兔的抗氧化能力。

② 飼糧中添加β-胡蘿卜素可以通過(guò)促進(jìn)卵泡發(fā)育和激素分泌，改善母兔的繁殖能力。

③ 本試驗(yàn)條件下，飼糧中β-胡蘿卜素適宜添加水平為30 mg/kg。