菊粉對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性、腸道組織形態(tài)和非特異性免疫能力的影響

付運(yùn)銀 范文浩 阮國良 何乃娟 李生瑄 李青松 方 劉 王 乾

(長(zhǎng)江大學(xué)小龍蝦繁育與健康養(yǎng)殖創(chuàng)新技術(shù)研究中心，荊州434025)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，其因營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美而深受消費(fèi)者喜愛[1]，現(xiàn)已成為當(dāng)前我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)淡水甲殼類動(dòng)物[2]。近年來，隨著集約化養(yǎng)殖水平的提高和對(duì)高產(chǎn)的追求，克氏原螯蝦的高密度養(yǎng)殖易導(dǎo)致其病害暴發(fā)[3]。在傳統(tǒng)的蝦類養(yǎng)殖過程中，經(jīng)常使用抗菌藥物治療疾病，但這致使耐藥性病原體的產(chǎn)生和養(yǎng)殖產(chǎn)品中抗生素的殘留，從而影響成蝦的品質(zhì)和食品安全。利用益生菌等飼料添加劑替代抗菌藥物來提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)及免疫力已在飼料行業(yè)受到極大關(guān)注[4]。菊粉(inulin)是由果糖單體通過β-2,1-糖苷鍵連接而成的聚合度為2～60的果糖聚合物，屬于非黏性、可發(fā)酵的益生元[5-6]，可促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌等有益菌的增殖，進(jìn)而在改善消化與吸收、腸道菌群與腸道結(jié)構(gòu)以及提高免疫與抗病等方面發(fā)揮重要作用[7]，因此在水產(chǎn)飼料添加劑中得到持續(xù)研究和廣泛應(yīng)用[8-9]。迄今，有關(guān)菊粉作為飼料添加劑的研究多見于魚類[7,10-13]，而在甲殼類僅見于凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[14-15]和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[16]。Dong等[17]研究了低聚果糖對(duì)克氏原螯蝦的免疫刺激作用，但有關(guān)菊粉對(duì)該蝦消化、生長(zhǎng)和抗逆性影響的研究則尚未見報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)通過探討在飼料中添加不同水平的菊粉對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性、腸道組織形態(tài)和非特異性免疫能力的影響，旨在為該蝦綠色環(huán)保飼料添加劑的開發(fā)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料的配制與成分測(cè)定

試驗(yàn)共配制6種等氮等能的飼料，飼料中菊粉為市售品(純度>99%)，飼料中菊粉添加水平分別為0(基礎(chǔ)飼料，對(duì)照組)、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%。飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。所有原料經(jīng)粉碎后，過80目篩網(wǎng)，按照配方要求準(zhǔn)確稱量，并逐級(jí)混勻后，加入魚油、豆油和適量水，再次混勻后，經(jīng)制粒機(jī)(NBS-150)擠壓為粒徑為2 mm的顆粒飼料，60 ℃烘干，密封袋分裝，標(biāo)記，-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。飼料的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量的測(cè)定分別采用凱氏定氮法、索氏抽提法、灼燒法與105 ℃恒溫烘干法。

表1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)蝦及其養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)用克氏原螯蝦購自湖北省公安縣某小龍蝦養(yǎng)殖基地，并通過濕法運(yùn)至室內(nèi)的養(yǎng)殖系統(tǒng)。在2周的室內(nèi)暫養(yǎng)期間，每天飽食投喂基礎(chǔ)飼料。正式試驗(yàn)開始前禁食24 h，選用規(guī)格一致[(6.58±0.16) g]、附肢齊全和活力正常的克氏原螯蝦240尾，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，養(yǎng)殖密度為10尾/箱，放養(yǎng)于由24個(gè)容積為84 L水族箱(0.6 m×0.4 m×0.35 m)組成的室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水位10 cm，分別投喂6種飼料。每日投喂2次(09:00和18:00)，投喂量為體重的3%。試驗(yàn)期間養(yǎng)殖用水為充分曝氣的自來水，每天換水1/3～1/2，用虹吸法吸出殘餌和糞便。每天觀察克氏原螯蝦健康與攝食狀況，定期檢查水質(zhì)，試驗(yàn)期間水溫保持在(23±2) ℃，pH為7.0～8.5，不間斷增氧，溶解氧含量≥6 mg/L，自然光照。試驗(yàn)期7周。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每組隨機(jī)抽取3尾蝦，冰上解剖并取后腸段的中間部分固定于4%多聚甲醛溶液，委托武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行腸道切片；養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每組隨機(jī)抽取6尾蝦，冰上解剖其胃和肝胰腺各0.10 g，用濾紙擦干其表面水分后放入EP管中，加入0.9 mL預(yù)冷生理鹽水，4 ℃勻漿，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，制成10%勻漿液，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 腸道組織形態(tài)觀察

用光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)對(duì)后腸組織切片進(jìn)行觀察和拍照。記錄每張切片中所有腸道黏膜皺襞的長(zhǎng)度和寬度。測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)以腸道黏膜皺襞頂端至基部中線為腸道黏膜皺襞長(zhǎng)度；以長(zhǎng)度的中點(diǎn)位置作垂線交于腸道黏膜皺襞2側(cè)，2交點(diǎn)之間的距離為腸道黏膜皺襞寬度。

1.5 消化酶和免疫酶活性測(cè)定

胃組織勻漿的上清液用于蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的測(cè)定；肝胰腺組織勻漿的上清液用于酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LZM)活性的測(cè)定。所有酶活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步處理，再使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Duncan氏法多重比較，以P<0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉對(duì)克氏原螯蝦胃組織中消化酶活性的影響

由表2可知，飼料中添加不同水平菊粉顯著影響克氏原螯蝦胃組織中消化酶活性(P<0.05)。隨著飼料中菊粉添加水平的提高，克氏原螯蝦胃組織中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。其中，0.40%～1.00%菊粉添加組胃組織中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.20%菊粉添加組胃組織中消化酶活性與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)；0.60%菊粉添加組胃組織中蛋白酶活性最高，而0.80%菊粉添加組胃組織中淀粉酶和脂肪酶活性最高。

表2 菊粉對(duì)克氏原螯蝦胃組織中消化酶活性的影響

2.2 菊粉對(duì)克氏原螯蝦腸道組織形態(tài)的影響

由圖1可知，飼料中添加不同水平菊粉可以改善克氏原螯蝦腸道組織形態(tài)。與對(duì)照組相比，隨著飼料中菊粉添加水平的提高，后腸整體輪廓更為清晰，腸道黏膜皺襞形成的縱嵴數(shù)量增加；各菊粉添加組腸壁內(nèi)的結(jié)締組織更為緊密，肌層更加明顯和完整。

A～F代表飼料中分別添加0、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%菊粉。W:寬度；L：長(zhǎng)度；EL：上皮層；CT：結(jié)締組織層；M：肌束；ML：肌層。

由表3可知，飼料中添加不同水平菊粉顯著影響克氏原螯蝦后腸黏膜皺襞長(zhǎng)度和寬度(P<0.05)。0.40%～1.00%菊粉添加組后腸黏膜皺襞長(zhǎng)度和寬度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.20%菊粉添加組后腸黏膜皺襞長(zhǎng)度和寬度與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)；0.40%菊粉添加組后腸黏膜皺襞長(zhǎng)度和寬度最高。

表3 菊粉對(duì)克氏原螯蝦后腸黏膜皺襞形態(tài)的影響

2.3 菊粉對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺免疫酶活性的影響

由表4可知，飼料中添加不同水平菊粉顯著影響克氏原螯蝦肝胰腺免疫酶活性(P<0.05)。隨著飼料中菊粉添加不同水平的提高，克氏原螯蝦肝胰腺AKP、ACP和LZM活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。0.20%～1.00%菊粉添加組肝胰腺AKP和ACP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.40%～1.00%菊粉添加組肝胰腺LZM活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.20%菊粉添加組肝胰腺LZM活性與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)；0.60%菊粉添加組肝胰腺AKP、ACP和LZM活性均為最高。

表4 菊粉對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺免疫酶活性的影響

3 討 論

3.1 菊粉對(duì)克氏原螯蝦胃組織中消化酶活性的影響

消化酶活性的高低反映動(dòng)物最基礎(chǔ)的消化生理特征，以及其對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力[10,18]，且蝦類的生長(zhǎng)與其消化酶活性有關(guān)[19]。有研究表明，益生元作為不可消化的水溶性膳食纖維，可以通過調(diào)節(jié)腸道黏度、產(chǎn)生維生素或酶來促進(jìn)消化[20-21]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)飼料中菊粉添加水平為0.60%～0.80%時(shí)，克氏原螯蝦胃組織中的3種主要消化酶活性均顯著高于對(duì)照組，表明菊粉能夠提高該蝦的消化酶活性。關(guān)于菊粉作為飼料添加劑可提高其他水產(chǎn)動(dòng)物的消化酶活性也有類似報(bào)道，如飼料中添加0.4%的菊粉可促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和淀粉酶活性[15]；飼料添加1.0%菊粉可顯著提高中華絨螯蟹腸道中的胰蛋白酶活性[16]；飼料添加1.0%菊粉可顯著提高虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[11]和暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[12]的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。因此，菊粉作為飼料添加劑可以提高不同水產(chǎn)動(dòng)物的消化酶活性，但其消化酶活性達(dá)最高值的所需菊粉添加水平可能是不同的。從本試驗(yàn)的前期生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)看，0.60%～0.80%菊粉添加組的存活率、終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于其他各組，且0.60%菊粉添加組的飼料系數(shù)最低。因此，本研究中飼料添加不同水平菊粉對(duì)克氏原螯蝦消化和生長(zhǎng)的影響是一致的，且飼料中添加0.60%的菊粉可顯著促進(jìn)該蝦的生長(zhǎng)和飼料利用。

3.2 菊粉對(duì)克氏原螯蝦腸道組織形態(tài)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加0.40%～1.00%菊粉可以改善克氏原螯蝦后腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，其原因可能是由于菊粉發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，并維持腸道的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[22-23]。腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善則有利于提高腸道黏膜屏障功能，并降低腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13,24]，且完善和發(fā)達(dá)的黏膜皺襞結(jié)構(gòu)可能具備免疫和病原微生物防御功能[7]。研究表明，菊粉能有效增加凡納濱對(duì)蝦腸肌肉厚度、腸絨毛長(zhǎng)度及腸絨毛凸起密度[25]。因此，菊粉可改善蝦類等水產(chǎn)動(dòng)物的腸道組織形態(tài)，從而有益于腸道健康。

目前，一般認(rèn)為十足目動(dòng)物的肝胰腺發(fā)揮著最主要的消化和吸收功能，而后腸僅具滲透調(diào)節(jié)和排糞的功能[26]。然而，Lu等[27]在研究甘露寡糖(MOS)對(duì)中華絨螯蟹后腸組織形態(tài)的影響時(shí)，結(jié)果表明添加0.3%的MOS可顯著提高其后腸黏膜皺襞的長(zhǎng)度和寬度，且推測(cè)MOS是通過增加腸上皮細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分子之間的接觸面積來增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。關(guān)于十足目動(dòng)物后腸是否不具有營(yíng)養(yǎng)吸收功能，還需從后腸的個(gè)體發(fā)生、腸黏膜表面結(jié)構(gòu)及其上皮細(xì)胞的吸收功能驗(yàn)證等方面進(jìn)行大量的試驗(yàn)研究加以確證。十足目作為一個(gè)龐大的動(dòng)物類群，其不同物種之間的形態(tài)及功能可能存在很大差異。相對(duì)于對(duì)蝦類及沼蝦類而言，螯蝦類的后腸部分的占比較大[28-29]；在個(gè)體發(fā)生上，真正無吸收功能的“后腸”至少應(yīng)該在其內(nèi)表面覆蓋有角質(zhì)層(cuticle)[26]，在本試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)后腸存在角質(zhì)層，這暗示著此“后腸”可能為真正的“中腸”部分，因而克氏原螯蝦后腸的形態(tài)改善是否有利于營(yíng)養(yǎng)吸收尚需深入研究。

3.3 菊粉對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺免疫酶活性的影響

AKP和ACP作為代謝調(diào)節(jié)酶，在甲殼動(dòng)物的非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[30-31]。LZM是由巨噬細(xì)胞分泌的堿性蛋白，可水解消化入侵微生物并誘導(dǎo)合成和分泌相關(guān)的免疫因子[32]，在先天免疫中具有非常重要的作用。本試驗(yàn)中，飼料中添加0.60%菊粉可使克氏原螯蝦肝胰腺發(fā)揮最高的AKP、ACP和LZM活性，表明菊粉可以增強(qiáng)該蝦的免疫功能。類似的研究表明，飼料中添加菊粉可以提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺ACP和酚氧化酶(PO)活性[15]，并降低白斑綜合征病毒(WSSV)的病毒載量和發(fā)病率[33]。此外，飼料中添加菊粉可顯著提高幼鯉(Cyprinuscarpio)血清溶菌酶活性、補(bǔ)體3和補(bǔ)體4含量以及腸道乳酸菌總數(shù)[10]。因此，菊粉可提高不同動(dòng)物的非特異性免疫能力[7]，其原因可能與腸道益生菌的豐度增加有關(guān)[14-15]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼料中添加菊粉可以提高克氏原螯蝦胃組織中消化酶活性，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)非特異性免疫能力，且以0.6%添加水平效果較佳。