不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料營養(yǎng)成分、青貯發(fā)酵品質(zhì)和瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

王 隆 李璟怡 歐陽可寒 瞿明仁 吳歡生,2 許蘭嬌 楊食堂 曹永強 楊宇玲 梁 歡*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，江西省營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學林學院，國家林草局木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心，南昌330045；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系高安實驗站，高安330800；4.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系隨州實驗站，湖北省隨州市隨縣畜牧技術(shù)推廣站，隨州441300)

芳樟(Cinnamomumcamphoravar.linalooliferaFujita.)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠闊葉喬木，原產(chǎn)于我國東南以及西南各地，是我國重要的天然香料樹種，其枝、葉、根中都富含精油，其中以葉中精油含量最高[1]。為了獲取較高的芳樟枝葉生物量，便于人工采收作業(yè)，獲取更大的經(jīng)濟效益，近些年我國已經(jīng)大面積推廣應用了矮化密植技術(shù)培育芳樟油用原料林——矮化芳樟人工林[2]。目前我國主要采用高溫水蒸氣蒸餾法提取芳樟枝葉中的精油[3]，而提取精油后獲得的副產(chǎn)物去油芳樟枝葉的用途主要是經(jīng)曬干后用于水蒸氣蒸餾環(huán)節(jié)的燃料，或者還田充當肥料等，這不僅造成資源的大量浪費，還會給環(huán)境帶來嚴重污染。因此，尋找其他方式處理去油芳樟枝葉，并改善其利用率具有重要的現(xiàn)實意義。

相比于傳統(tǒng)芳樟樹，矮化芳樟樹生長期短，樹體高度在1 m以下，枝葉更細嫩，木質(zhì)化程度更低[4]。張峰[5]測定了矮化芳樟枝葉的主要成分，發(fā)現(xiàn)矮化芳樟枝葉的粗脂肪(EE)含量為5.6%，粗蛋白質(zhì)(CP)含量為19.3%，粗纖維(CF)含量為5.5%，粗灰分(Ash)含量為5.7%，總磷(TP)含量為0.3%，鈣(Ca)含量為0.7%，總多酚含量為2.2%，總多糖含量為6.1%，各指標均在優(yōu)良牧草的標準范圍內(nèi)。因此，去油芳樟枝葉具有成為優(yōu)質(zhì)木本飼料的潛力，可擴大南方地區(qū)的粗飼料資源。但是去油芳樟枝葉具有特殊氣味，且其含水量較大，不利于長時間保存，直接作為飼料飼喂反芻動物效果較差，而經(jīng)過青貯處理可有效改善青貯原料的特殊氣味[6]。但由于去油芳樟枝葉中水溶性碳水化合物含量較低，直接青貯較難調(diào)制出高品質(zhì)青貯飼料，因此需要使用青貯添加劑進行處理。然而，目前尚未見到有關去油芳樟枝葉青貯發(fā)酵的研究報道。大量研究表明，在青貯原料中添加葡萄糖[7-9]、有機酸[10-12]和纖維素酶[13-15]可以有效提高青貯飼料的品質(zhì)。因此，本試驗以去油芳樟枝葉作為原料，探討添加葡萄糖、混合有機酸和纖維素酶對去油芳樟枝葉青貯飼料營養(yǎng)成分、青貯發(fā)酵品質(zhì)和瘤胃體外發(fā)酵特性的影響，篩選適合去油芳樟枝葉青貯發(fā)酵的青貯添加劑，旨在為去油芳樟枝葉的飼料化應用提供科學依據(jù)，為去油芳樟枝葉優(yōu)質(zhì)青貯的制作提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

去油芳樟枝葉取自江西省撫州市金溪縣江西天香香料有限公司芳樟基地種植的矮化芳樟樹。葡萄糖、甲酸、乙酸、丙酸及纖維素酶均為分析純。青貯所用的塑料桶于市場購買，容積為1 L。

1.2 青貯飼料調(diào)制

將去油芳樟枝葉用鍘刀切碎至2 cm左右，混合均勻后備用，去油芳樟枝葉青貯前營養(yǎng)成分見表1。試驗采用單因素試驗設計，共設置4個組：對照組(CON組，不添加任何青貯添加劑)、葡萄糖組(GLU組，添加20 g/kg葡萄糖)、混合有機酸組(MOA組，按照7∶1∶2的體積比例將甲酸、乙酸和丙酸混合，添加量為6 mL/kg)和纖維素酶組(CE組，添加2 g/kg纖維素酶)，各青貯添加劑的添加劑量均以青貯原料鮮重為基礎。各組中的青貯添加劑均充分溶解在10 mL蒸餾水中，隨后用微型噴霧劑噴灑在切碎混勻的去油芳樟枝葉上，CON組只噴灑10 mL蒸餾水，再次混勻，取500 g裝入1 L的青貯桶中密封，每組設置4個重復，青貯45 d后開封，取樣分析。

表1 去油芳樟枝葉青貯前營養(yǎng)成分

1.3 測定指標及方法

1.3.1 化學成分

分別稱取200 g青貯前和青貯后去油芳樟枝葉樣品，置于烘箱中65 ℃烘干48 h，取出烘干樣，經(jīng)實驗室粉碎機粉碎后過40目篩待測。干物質(zhì)(DM)、CP、EE和Ash含量參照AOAC(2005)[16]的方法進行測定。酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量參照Van Soest等[17]洗滌纖維法，采用纖維分析儀(ANKOMA200i Fiber Analyzer，美國ANKOM公司)進行測定。水溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法[18]進行測定。淀粉含量采用高氯酸水解-蒽酮比色法[19]進行測定。

1.3.2 碳水化合物組分

碳水化合物組分指標分析參照NRC(2016)[20]的方法，計算以下指標：總碳水化合物(CHO)、非中性洗滌纖維性碳水化合物(non-NDF)、有機酸(OA)、淀粉(CB1)、可溶性糖(CA)、不可利用中性洗滌纖維(CC)、中性洗滌可溶性纖維(CB2)、可利用中性洗滌纖維(CB3)，各組分的單位均為%DM。

1.3.3 預測能值

總可消化養(yǎng)分(TDN)根據(jù)Weiss等[21]的方法計算，以下指標中各組分的單位均為%DM。計算公式如下：

TDN(%)=0.98×(100-NDFn-CP-Ash-EE)+
0.93×CP+2.25×(EE-1)+0.75×(NDFn-ADL)×
[1-(ADL/NDFn)×0.667]-7。

式中：NDFn表示無氮中性洗滌纖維[NDFn=NDF-中性不溶蛋白(NDICP)]。

代謝能(ME)、消化能(DE)、增重凈能(NEg)和維持凈能(NEm)參照NRC(2016)[20]，在TDN基礎上進行計算，公式如下：

ME(MJ/kg)=0.82×DE(MJ/kg)；
DE(MJ/kg)=0.044 09×TDN(%DM)；
NEg(MJ/kg)=1.42×ME(MJ/kg)-0.174×
ME2(MJ/kg)+0.012 2×ME3(MJ/kg)-1.65；
NEm(MJ/kg)=1.37×ME(MJ/kg)-0.138×
ME2(MJ/kg)+0.010 5×ME3(MJ/kg)-1.12。

1.3.4 青貯發(fā)酵品質(zhì)

取去油芳樟枝葉青貯飼料樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，充分攪拌均勻，用榨汁機攪碎1 min，先后用4層紗布和定性濾紙過濾，收集過濾后的浸出液，再用pH計[DELTA320 pH計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]測定去油芳樟枝葉青貯飼料浸出液的pH；0.45 μm的濾膜過濾后，用高效液相色譜儀(Waters-Baseline520型，美國Waters公司)測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量，分析條件為波長214 nm，C18柱溫維持在30 ℃，流動相為0.02 mol/L KH2PO4/H3PO4，pH 2.37，流速1 mL/min，進樣量10 μL[22]；氨態(tài)氮(NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[23]。

1.3.5 瘤胃體外發(fā)酵特性

試驗選用的瘤胃液供體動物為4只安裝有永久性瘤胃瘺管的錦江黃牛，體重為(365±27) kg，單圈飼養(yǎng)。參考我國《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 815—2004)，以350 kg肉牛日增重500 g 所需綜合凈能配制基礎飼糧，每日定時飼喂2次(08:00和18:00)，自由飲水?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

試驗前，根據(jù)Menke等[24]的配方配制瘤胃緩沖液，并與從瘤胃液供體牛上采集的瘤胃液按2∶1的比例混合，準確量取60 mL混合溶液于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)底物為500 mg去油芳樟枝葉青貯飼料，培養(yǎng)瓶通過1根帶針頭的橡膠管與帶有刻度的注射器連接，便于記錄產(chǎn)氣量(GP)，培養(yǎng)裝置中體外批次培養(yǎng)裝置參照盧德勛[25]和程茂基[26]所述的方法進行。裝置主體為振蕩速率和水浴溫度均可自由調(diào)節(jié)的恒溫水浴搖床，準備就緒后，接通體外培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，立即用pH計測定培養(yǎng)液pH，將瓶中濾渣轉(zhuǎn)移至已事先烘干稱重的尼龍袋(孔徑200目)中并用蒸餾水多次沖洗培養(yǎng)瓶，使濾渣完全轉(zhuǎn)入尼龍袋中，采用恒重干燥法測定體外干物質(zhì)消化率(IVDMD)，采集濾液樣品，于-20 ℃冷凍保存，用于瘤胃發(fā)酵參數(shù)[NH3-N、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和微生物蛋白質(zhì)(MCP)含量]的測定。NH3-N和VFA(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)含量的測定方法同青貯發(fā)酵品質(zhì)分析，MCP含量采用比色法[27]進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗測定各項數(shù)據(jù)使用Excel 2019進行初步整理后，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果用平均值和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料的DM、NDF、ADF和ADL含量無顯著影響(P>0.05)。混合有機酸組的CP和EE含量顯著高于其他各組(P<0.05)；葡萄糖組的CP含量顯著高于對照組和纖維素酶組(P<0.05)，Ash含量顯著低于其他各組(P<0.05)。

表3 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料營養(yǎng)成分的影響(干物質(zhì)基礎)

2.2 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料碳水化合物組分的影響

由表4可知，不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料的非中性洗滌纖維碳水化合物、淀粉、不可利用纖維和可利用中性洗滌纖維含量無顯著影響(P>0.05)。纖維素酶組的有機酸含量最高，顯著高于對照組(P<0.05)；混合有機酸組的總碳水化合物含量顯著低于其他各組(P<0.05)；纖維素酶組的中性洗滌可溶纖維含量最低，顯著低于對照組(P<0.05)；葡萄糖組的可溶性糖含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料碳水化合物組分的影響

2.3 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料預測能值的影響

由表5可知，不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料的TDN、DE、ME、NEm和NEg均無顯著影響(P>0.05)。

表5 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料預測能值的影響

2.4 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表6可知，各組去油芳樟枝葉青貯飼料中均未檢測到丁酸，不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料的NH3-N含量無顯著影響(P>0.05)。纖維素酶組的pH最低，顯著低于其他各組(P<0.05)；纖維素酶組的乳酸、乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量均為最高，其中，纖維素酶組的乳酸含量顯著高于混合有機酸組和葡萄糖組(P<0.05)，TVFA和乙酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；混合有機酸組和葡萄糖組的丙酸含量顯著高于對照組和纖維素酶組(P<0.05)；混合有機酸組的TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表6 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.5 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

由表7可知，不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)液的GP及AA、PA、BA、IBA、VA、IVA和NH3-N含量均無顯著影響(P>0.05)。葡萄糖組的pH最低，顯著低于其他各組(P<0.05)；葡萄糖組的IVDMD、MCP和TVFA含量均最高，其中，葡萄糖組的IVDMD顯著高于混合有機酸組(P<0.05)，MCP含量顯著高于對照組和混合有機酸組(P<0.05)，TVFA含量顯著高于對照組和混合有機酸組(P<0.05)；纖維素酶組的TVFA含量顯著高于混合有機酸組(P<0.05)。

表7 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

3 討 論

3.1 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

青貯飼料的蛋白質(zhì)降解與青貯發(fā)酵早期pH密切相關。本試驗的研究結(jié)果表明，添加混合有機酸顯著提高了去油芳樟枝葉青貯飼料的CP含量，這與劉庭玉等[28]在青貯天然草地牧草中添加甲酸、張晴晴等[29]在燕麥的青貯發(fā)酵中添加混合有機酸的結(jié)果一致，原因可能是添加有機酸直接酸化了青貯原料，使得pH快速下降，抑制了腐敗菌和梭菌等有害微生物的生長繁殖，同時降低了青貯發(fā)酵早期植物自身呼吸作用對CP的消耗，有效保留了營養(yǎng)物質(zhì)[30]。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，添加混合有機酸顯著提高了去油芳樟枝葉青貯飼料的EE含量，原因可能是本試驗添加的甲酸、乙酸和丙酸本身就屬于短鏈揮發(fā)性脂肪酸，增加了青貯飼料原料中EE含量。

本試驗結(jié)果表明，添加葡萄糖顯著提高了去油芳樟枝葉青貯飼料的可溶性糖含量，原因可能有2個方面：一方面，添加葡萄糖直接提高青貯原料中WSC含量，進而提高去油芳樟枝葉青貯飼料的WSC含量；另一方面，在青貯發(fā)酵時，WSC是乳酸菌發(fā)酵的底物，由于WSC的添加促進了青貯原料中乳酸菌在青貯早期的生長繁殖，使得青貯發(fā)酵更早進入穩(wěn)定期，減少了其他雜菌對發(fā)酵底物的消耗以及蛋白質(zhì)的水解[31]。因此，本試驗葡萄糖組的去油芳樟枝葉青貯飼料CP含量也顯著高于對照組和添加纖維素酶組，這與吳金彩等[32]和孫肖慧等[33]的研究結(jié)果一致。

纖維素酶是一種復合酶，青貯發(fā)酵時添加纖維素酶不僅可將植物細胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖降解轉(zhuǎn)化為單糖，為乳酸菌快速繁殖提供底物，還可以降低青貯飼料中纖維的含量，提高青貯飼料的營養(yǎng)品質(zhì)[15]。本試驗結(jié)果表明，添加纖維素酶提高了去油芳樟枝葉青貯飼料碳水化合物組分中有機酸含量，降低了中性洗滌可溶纖維含量，表明纖維素酶有效促進去油芳樟枝葉細胞壁的分解。

3.2 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH是評價青貯發(fā)酵品質(zhì)好壞的重要指標，降低pH可促進乳酸菌發(fā)酵并改善青貯品質(zhì)，各有機酸(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)及TVFA含量是反映發(fā)酵過程好壞的重要指標之一[34]。因植物細胞的細胞壁為結(jié)構(gòu)性多糖，不能被微生物直接利用，而纖維素酶可以將細胞壁結(jié)構(gòu)性多糖降解為能夠被微生物所利用的單糖，從而為乳酸發(fā)酵提供更多的底物，起到改善青貯飼料品質(zhì)的作用。任志花等[35]、朱妮等[36]和李茂等[37]研究結(jié)果均表明，添加纖維素酶可以顯著降低青貯飼料的pH。本試驗結(jié)果表明，添加纖維素酶降低了去油芳樟枝葉青貯飼料的pH，提高了TVFA含量和乳酸含量，與上述研究結(jié)果一致。此外，本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，添加混合有機酸顯著提高了去油芳樟枝葉青貯飼料TVFA含量，原因可能是添加混合有機酸直接提高青貯原料中揮發(fā)性脂肪酸的含量，進而提高青貯飼料中TVFA含量。

本試驗各組去油芳樟枝葉青貯飼料中均沒有檢出丁酸，這可能與樟樹枝葉本身富多種具有抑菌作用的活性成分有關，已有文獻報道過的樟樹枝葉中抑菌成分有多酚類、黃酮類、萜烯類、揮發(fā)油等[5]。常璐璐等[38]研究發(fā)現(xiàn)，芳樟枝葉提取物對青霉、曲霉等真菌具有抑菌性，李艷等[39]通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀研究樟樹枝葉素油的成分組成和抑菌活性，檢測出40種成分，且樟樹枝葉素油對大腸桿菌、真菌等具有優(yōu)良的抑菌作用，可見芳樟枝葉中含有多種抑菌活性成分，是一種很好的天然防腐劑[2]，有利于制作青貯飼料。

3.3 不同青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

pH是衡量反芻動物瘤胃發(fā)酵的重要指標之一，適宜的pH為瘤胃內(nèi)的微生物提供了合適的生存環(huán)境，由于反芻動物的采食、消化等正常生理活動使得瘤胃液pH處于一個動態(tài)變化的過程，其正常變化范圍為5.5～7.5[22]。本試驗各組體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH為6.58～6.79，均在正常瘤胃液pH變化范圍內(nèi)，其中，葡萄糖組的pH最低，顯著低于其他各組，說明添加葡萄糖可以促進去油芳樟枝葉青貯飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度。飼料在瘤胃內(nèi)瘤胃微生物的分解作用下分解程度的強弱，可以通過計算瘤胃干物質(zhì)降解率來反映[40]，粗飼料經(jīng)過瘤胃微生物發(fā)酵后的GP是評價粗飼料可發(fā)酵程度的重要指標，不僅可以體現(xiàn)飼料營養(yǎng)價值的高低，也可以反映瘤胃微生物利用底物的程度[41]。而MCP是反芻動物維持正常生理活動重要的氮源之一，可為機體正常活動提供40%～80%的氮需要量，用以合成各類蛋白質(zhì)。TVFA含量反映了飼料在瘤胃內(nèi)發(fā)酵的情況，是反芻動物生長發(fā)育的主要能量來源，反芻動物體內(nèi)碳代謝碳流量的2/3是由瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸提供的，達到機體總能需要量的70%～80%[42]。本試驗結(jié)果表明，葡萄糖組去油芳樟枝葉青貯飼料的IVDMD、GP以及MCP和TVFA含量均為最高，表明添加葡萄糖可以促進去油芳樟枝葉青貯飼料在瘤胃內(nèi)降解，進而改善瘤胃發(fā)酵。

4 結(jié) 論

使用葡萄糖、混合有機酸和纖維素酶3種青貯添加劑對去油芳樟枝葉青貯飼料的營養(yǎng)成分、青貯發(fā)酵品質(zhì)以及瘤胃體外發(fā)酵特性均有一定的改善作用，通過對不同指標進行綜合分析，各組去油芳樟枝葉青貯飼料的綜合營養(yǎng)價值由低到高的排序為：對照組<混合有機酸組<纖維素酶組<葡萄糖組。