甘蔗糖蜜酵母發(fā)酵濃縮液對泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系的影響

張宜輝 寧麗麗 武小姣 郭 靜 張笑然 趙國琦,4,5*

(1.揚州大學實驗農(nóng)牧場，揚州225009；2.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，揚州225009；3.廣西丹寶利酵母有限公司，來賓546100；4.揚州大學農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，揚州225009；5.揚州大學教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州225009)

甘蔗糖蜜酵母發(fā)酵濃縮液(cane condensed molasses soluble fromSaccharomycescerevisiae，CMS)是甘蔗糖蜜經(jīng)釀酒酵母菌發(fā)酵濃縮而成的產(chǎn)品，其中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、有機酸、維生素、礦物質(zhì)以及在發(fā)酵過程中合成的未知生長因子[1-2]。發(fā)酵液中微生物產(chǎn)生的蛋白酶可以將大分子的蛋白質(zhì)分解為小分子肽，進而提高動物腸道對營養(yǎng)因子的利用效率[3]。CMS具有芳香氣味，呈液體黏稠狀，可提高飼料適口性，降低粉塵，改善飼料質(zhì)量。已有研究表明，豬[4]和牛[1,5-6]飼糧中添加1%～5% CMS后采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率可顯著提高。適量添加CMS還可以改善瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃微生物活性，促進蛋白質(zhì)合成，降低瘤胃液中的氨濃度[7]。因此，CMS作為一種新型綠色飼料，對緩解飼料資源緊張和環(huán)境污染具有重要意義。飼糧中添加CMS可提高奶牛生產(chǎn)性能可能是因為其對瘤胃微生物區(qū)系產(chǎn)生了一定影響，但目前尚沒有相關(guān)報道。為了探明CMS對瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系產(chǎn)生的具體影響，有必要進行相關(guān)的深入研究。高通量測序技術(shù)[8-9]可以進行全基因組測序，為胃腸道微生物區(qū)系的深入研究提供了可能。因此，本試驗采用高通量測序技術(shù)，探討CMS對泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和瘤胃微生物區(qū)系的影響，以期為CMS在泌乳奶牛飼糧中的應(yīng)用提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的CMS由廣西某酵母有限公司提供。它是甘蔗糖蜜的酵母培養(yǎng)物離心分離出酵母后的液體，經(jīng)蒸發(fā)濃縮成紅褐色的黏稠液體。CMS營養(yǎng)成分見表1。

表1 CMS營養(yǎng)成分(風干基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計

飼養(yǎng)試驗于揚州大學實驗農(nóng)牧場進行。選取胎次(2～3胎)、產(chǎn)奶量[(29.1±2.2) kg]、泌乳天數(shù)[(116±25) d]和體況等情況相似的健康荷斯坦奶牛60頭，隨機分為4組，每組15頭牛。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧干物質(zhì)基礎(chǔ)上分別添加1%(CMS1組)、3%(CMS2組)和5%(CMS3組)的CMS，各組飼糧基本保持能氮一致。預(yù)試期14 d，正試期54 d。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2001)奶牛營養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表2項目Items組別 Groups對照 ControlCMS1CMS2CMS3中性洗滌纖維 NDF36.3536.0335.3634.65酸性洗滌纖維 ADF19.9519.8919.7519.61粗灰分 Ash7.327.678.668.90鈣 Ca0.870.870.880.88磷 P0.440.440.440.44

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗牛只采用拴系式飼養(yǎng)，每2頭牛食槽之間用石塊隔開，保證其可以自由采食飼糧，并且槽內(nèi)有3%～8%的剩料量，CMS每日分3次(06:00、13:00和20:00)與飼糧混勻后飼喂，自由飲水，保持舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生。

1.4 樣品的采集與測定

1.4.1 采食量的測定

每日單頭測定各組牛的飼糧供給量和剩余量，同時每周連續(xù)2 d早、中、晚采集飼糧原料與剩料以測定常規(guī)營養(yǎng)成分，計算奶牛的干物質(zhì)采食量(DMI)和飼料轉(zhuǎn)化率。

DMI=(投料量-剩料量)×DM；
飼料轉(zhuǎn)化率=4%標準乳產(chǎn)量/DMI。

1.4.2 產(chǎn)奶量的測定

試驗牛只采用管道式擠奶方式，每日跟隨工作人員記錄每頭奶牛的產(chǎn)奶量，計算產(chǎn)奶量和4%標準乳產(chǎn)量。

4%標準乳產(chǎn)量=產(chǎn)奶量×(0.4+15×乳脂率)。

1.4.3 瘤胃液樣品的采集

正試期第54天，每組選取12頭牛，于晨飼后3 h用口腔采集器(武漢科立博有限公司)從奶牛瘤胃中采集100 mL瘤胃內(nèi)容物，用滅菌4層紗布過濾，之后用便攜式pH計立即測定其pH，過濾后的瘤胃液樣品分裝至5 mL凍存管中，分成4份保存。1份加入25%偏磷酸混勻后放置在-20 ℃冰箱中用于揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的測定[10]；1份添加0.5 mol HCl放置在-20 ℃冰箱中用于氨態(tài)氮(NH3-N)含量的測定[11]；1份放置在-20 ℃冰箱中用于微生物蛋白(MCP)含量的測定[12]；1份保存在-80 ℃超低溫冰箱中用于高通量測序。

1.4.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

瘤胃液的pH采用便攜式pH計(PB-21型，北京賽多利斯科學儀器有限公司)測定；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定；MCP含量采用嘌呤法測定；VFA含量采用氣相色譜法(7890A-7697A，頂空氣相色譜儀)測定。

1.4.5 瘤胃微生物區(qū)系的測定

瘤胃細菌群落結(jié)構(gòu)分析采用高通量測序HiSeq2500 PE250平臺(上海華大基因科技有限公司)。引物選用16S V4區(qū)的515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行擴增。按鄧波波[13]的方法處理序列，使用Qiime2軟件以一致性(identity)為99%將序列聚類成為操作分類單位(OTUs)，繪制韋恩圖分析共同存在的OTUs和特有的OTUs，并通過Excel繪制各樣本菌群在門和屬水平相對分布情況柱形圖；通過Qiime2 diversity分析樣本內(nèi)細菌α多樣性和樣本間細菌β多樣性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，然后使用SPSS 23.0軟件的one way-ANOVA程序進行單因素方差分析，使用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性的判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加CMS對泌乳奶牛生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，飼糧中添加CMS對泌乳奶牛DMI、產(chǎn)奶量、4%標準乳產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化率均無顯著影響(P>0.05)。CMS1組的DMI、產(chǎn)奶量、4%標準乳產(chǎn)量比對照組分別提高了6.0%、7.7%和7.9%(P>0.05)。

表3 添加CMS對泌乳奶牛生產(chǎn)性能的影響

2.2 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，飼糧中添加CMS對泌乳奶牛瘤胃液pH、NH3-N、VFA含量和乙酸/丙酸值無顯著影響(P>0.05)。CMS1組和CMS2組的瘤胃液MCP含量顯著高于對照組(P<0.05)。瘤胃液NH3-N含量隨CMS添加量的增加而逐漸降低(P>0.05)。

表4 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 測序數(shù)據(jù)量及物種豐度分析

從圖1可以看出，曲線末端趨于平緩，說明本次測序的采樣量足夠，測序量近似覆蓋了所有物種[14]。

圖1 物種累積曲線

2.4 韋恩圖分析

韋恩圖可以反映多個樣品之間共有和特有的OTUs，能夠直觀表現(xiàn)出樣品間OTUs的重疊情況。從圖2可以看出，各組共有的OTUs為2 101個，其中對照組特有的OTUs為36個，CMS1組特有的OTUs為44個，CMS2組特有的OTUs為36個，CMS3組特有的OTUs為29個。因此，CMS1組特有的OTUs高于其他各組，并且CMS1組和CMS2組共有相同的OTUs較多。

2.5 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃細菌多樣性的影響

2.5.1 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃細菌α多樣性的影響

覆蓋率數(shù)值越高，樣品中序列沒有被測出來的概率越低；Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)反映樣品中細菌群落的豐富度；Shannon指數(shù)可以反映樣品中細菌群落的多樣性。由表5可知，各組樣品覆蓋率均為99%，說明所有樣品檢測數(shù)據(jù)可靠。飼糧中添加CMS對瘤胃液中Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

Control、MC1、MC2、MC3分別代表對照組、CMS1組、CMS2組和CMS3組。下圖同。

表5 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃細菌α多樣性的影響

2.5.2 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃細菌β多樣性的影響

從圖3可以看出，對照組、CMS2組和CMS3組的微生物組成相似度很高，CMS1組的微生物組成和其他各組相比差異較大。

圖3 偏最小二乘判別分析

2.6 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.6.1 門水平上物種的結(jié)構(gòu)和相對豐度

瘤胃液樣品分析后，根據(jù)物種注釋結(jié)果制作物種相對豐度柱狀圖。圖4是門水平上排名前10的瘤胃液細菌相對豐度柱狀圖，其中，門水平上相對豐度較高的菌為：擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。飼糧中添加CMS在門水平上對泌乳奶牛瘤胃菌群相對豐度均無顯著影響(P>0.05)，但是有增加軟壁菌門相對豐度的趨勢(P=0.08)。

圖4 門水平上物種相對豐度柱狀圖

2.6.2 屬水平上物種的結(jié)構(gòu)和相對豐度

瘤胃液樣品分析后根據(jù)物種注釋結(jié)果制作物種相對豐度柱狀圖。圖5是屬水平上的物種相對豐度柱狀圖，物種豐富度低于0.5%的物種全部合并成其他(Others)。由圖5可以看出，屬水平上相對豐度較高的菌為：普雷沃氏菌屬(Prevotella)和琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)。飼糧中添加CMS在屬水平上對泌乳奶牛瘤胃菌群相對豐度均無顯著影響(P>0.05)，但CMS1組的Others菌屬相對豐度較對照組提高17.02%。

圖5 屬水平上物種相對豐度柱狀圖

3 討 論

3.1 添加CMS對泌乳奶牛生產(chǎn)性能的影響

影響動物DMI除了自身遺傳力、年齡、體況、生理狀態(tài)以外，還與飼糧因素、環(huán)境因素和飼養(yǎng)管理技術(shù)有關(guān)[15]。飼糧是影響奶牛DMI的主要因素[16]，包括精粗比、營養(yǎng)成分和適口性等。本試驗各試驗組飼糧采用等能等氮原則配制，于同一牛舍飼喂。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加CMS對DMI無顯著差異，但是CMS1組和CMS3組的DMI均高于對照組。這可能是因為CMS中保留了甘蔗糖蜜中的芳香氣味，一定程度上增加了飼糧的適口性，使得奶牛更喜歡采食。

產(chǎn)奶量主要受遺傳、生理以及外界因素的影響，其中外界因素對奶牛產(chǎn)奶能力的影響比較大，而飼糧配方及營養(yǎng)水平是外界因素中最主要的[17]。吳宗進等[6]和許袖等[18]的研究表明，添加酵母糖蜜對泌乳奶牛的生產(chǎn)性能并無顯著影響。而在毛江[5]的研究中，奶牛的采食量和產(chǎn)奶量隨著CMS飼喂水平的增加而增加，效果最好的是1.50%替代組。這可能是不同的CMS用量和動物健康狀況導致了不一樣的研究結(jié)果。CMS1組的產(chǎn)奶量和4%標準乳產(chǎn)量均高于對照組，可能是由于DMI不同引起的。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)過度使用CMS會降低其采食量和產(chǎn)奶量。因此，奶牛飼糧中適量添加CMS能夠提高奶牛的生產(chǎn)性能，這與之前在奶牛飼糧中添加糖蜜的研究結(jié)果[19]一致。

3.2 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

Schmitz等[20]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃液pH范圍通常在6.0～7.0，最適于生成VFA的pH范圍為6.2～6.6，最適于NH3-N利用的pH范圍為5.7～6.2。飼糧中精料比例過高會導致pH下降，pH過低會引起亞急性瘤胃酸中毒、肝膿腫、蹄葉炎、乳脂降低等營養(yǎng)代謝性疾病[21-22]。本研究中，各組pH都處于正常范圍，飼糧中添加CMS對泌乳奶牛瘤胃液pH無顯著影響，這可能是因為對照組和CMS組的飼糧精粗比一致。

NH3-N含量是瘤胃氮代謝中最重要的指標之一，同時也是MCP合成的底物。瘤胃中NH3-N含量反映了飼糧的降解和NH3-N吸收之間的平衡關(guān)系[23-24]。本研究中，飼糧添加CMS對NH3-N含量無顯著影響，但隨著CMS添加量的增加而降低，這可能是由于瘤胃微生物區(qū)系的變化所致。研究表明，適宜MCP合成的NH3-N含量為5～25 mg/dL[25]，本試驗各組NH3-N含量都處于正常范圍。瘤胃MCP為反芻動物提供40%～80%機體需要的蛋白質(zhì)，MCP含量可以反映瘤胃微生物的豐富度和活性。MCP合成主要受可降解碳水化合物和蛋白質(zhì)的影響[26-28]。El Khidir等[29]和毛江等[5]的研究表明，糖蜜與粗飼糧結(jié)合可以提高瘤胃液中MCP的合成效率。本試驗CMS1組和CMS1組MCP含量顯著提高，可能是因為CMS是酵母菌發(fā)酵濃縮副產(chǎn)物，更容易被瘤胃吸收以及微生物利用。

飼糧組成可以影響瘤胃發(fā)酵類型和VFA組成。VFA是飼糧中碳水化合物經(jīng)過瘤胃微生物發(fā)酵后得到的產(chǎn)物，為反芻動物機體提供70%以上的能量[30]。本研究中，飼糧添加CMS對泌乳奶牛瘤胃中的總VFA、乙酸、丙酸和丁酸含量均無顯著影響，可能與飼糧等能等氮配制和添加量少有關(guān)。Fernández等[31]在安裝瘤胃瘺管的美利奴母羊飼糧中添加CMS，發(fā)現(xiàn)其對瘤胃中的VFA含量影響不顯著，這與本試驗的研究結(jié)果一致。

3.3 添加CMS對泌乳奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

物種累積曲線圖能夠反映測序數(shù)據(jù)量是否合理[32]。本研究中，物種累積曲線圖中曲線末端上升趨勢逐漸平緩，說明本次測序的采樣量足夠，測序量近似覆蓋了所有物種，測序深度足夠。另外各組樣品覆蓋率均為99%，更說明所有樣品測定合宜。韋恩圖反映CMS1組特有的OTUs高于其他各組，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)圖反映CMS1組的微生物組成和對照組相比有一定差異，說明飼喂1% CMS能夠提高奶牛瘤胃微生物的多樣性。Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中細菌群落的豐富度，其數(shù)值越高代表豐富度越高；Shannon指數(shù)可以反映群落的多樣性。本研究中，各組之間瘤胃液中的Chaol指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)無顯著差異，說明飼糧中添加CMS對泌乳奶牛瘤胃細菌的豐富度和多樣性不會產(chǎn)生顯著影響，可能是因為各組飼糧的營養(yǎng)成分差異不大。

反芻動物依賴于宿主與瘤胃微生物的共生關(guān)系，飼糧中原有的糖和蛋白質(zhì)很少或根本沒有直接進入動物體內(nèi)，它們都要先通過瘤胃內(nèi)的細菌發(fā)酵進行處理才能被機體吸收利用[33]?？紤]到瘤胃微生物對飼料轉(zhuǎn)化的重要性，許多研究都想要通過調(diào)控瘤胃發(fā)酵來提高動物生產(chǎn)力。本研究在門水平上對奶牛瘤胃微生物群落進行分析，發(fā)現(xiàn)各組奶牛瘤胃中的優(yōu)勢菌群都是擬桿菌門和厚壁菌門，這與Bi等[34]的研究結(jié)果一致。擬桿菌門對于瘤胃中非纖維物質(zhì)的降解十分重要，厚壁菌門、螺旋菌門和纖維桿菌門都有助于降解富含纖維素的飼草[35]，屬于有益菌。各組之間門水平上菌群相對豐度均無顯著差異，但是螺旋菌門和纖維菌門相對豐度隨著CMS的添加也在增加，說明飼喂CMS可能會通過調(diào)節(jié)微生物結(jié)構(gòu)來改善動物健康，提高其生產(chǎn)性能。本研究在屬水平上發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬為泌乳奶牛瘤胃優(yōu)勢菌群。這與Bowen等[36]的研究結(jié)果一致，基本上所有反芻動物的優(yōu)勢菌屬都是擬桿菌門的普氏菌屬。普雷沃氏菌屬可以消化利用淀粉，并且可以通過與纖維降解菌共培養(yǎng)有效利用木聚糖和果膠，還能降解非結(jié)構(gòu)性的碳水化合物和蛋白質(zhì)[37]。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加1%和3% CMS能夠顯著提高泌乳奶牛瘤胃中MCP含量。

② 飼糧中添加1% CMS，泌乳奶牛瘤胃菌群的多樣性有提高，優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門,優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬和琥珀酸菌屬。

③ 飼糧中添加1% CMS更有利于泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵和產(chǎn)奶性能提高。