1 例臨床診斷為17-α 羥化酶/17，20-裂解酶缺陷癥患兒及其父母和哥哥的基因檢測分析

席可望，李珊，湯旭磊，傅松波，李娟，成建國

1 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730099；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科3 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一種較常見的常染色體隱性遺傳病?；颊咭蚰I上腺皮質(zhì)類固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶缺乏，引起皮質(zhì)激素合成障礙，刺激促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）合成增多，導(dǎo)致腎性高血壓、低血鉀、性發(fā)育障礙等［1］。CAH 主要分為兩大類：典型腎上腺皮質(zhì)增生癥和非典型腎上腺皮質(zhì)增生癥，前者以21-羥化酶缺陷（90%～95%）最常見，后者包括11β-羥化酶缺陷、17-α 羥化酶/17，20-裂解酶缺陷癥、3β 脫氫酶缺陷、皮質(zhì)酮甲基氧化酶缺陷及先天性類脂質(zhì)性腎上腺增生［2］。其 中17-α 羥化 酶/17，20-裂解酶缺陷癥（17α-hydroxylase/17，20-lyase deficiency，17OHD）較為罕見，約占CAH 的1%［2］。細胞色素P450c17 酶（Cytochrome P450c17 enzyme，CYP17A1）基因突變可導(dǎo)致類固醇激素缺乏，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素和性激素減少，但因中間產(chǎn)物去氧皮質(zhì)酮（Desoxycorticosterone，DOC）累積代償皮質(zhì)醇不足，患者出生后的一段時間并無特殊臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致17OHD早期很難確診，且部分患者無陽性家族遺傳史?；蛉毕莺Y查可有助于明確疾病診斷，指導(dǎo)臨床制定合理的方案，提高患者生存質(zhì)量［3］。目前臨床關(guān)于17OHD的診斷及治療方法相關(guān)報道較少。我們收治了1例疑似17OHD的患兒，檢測患兒及其家系的基因情況，了解17-α羥化酶/17，20-裂解酶缺陷癥患兒的基因變異及遺傳情況，為本病的診斷及治療方案的制定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒，3 歲，女性外貌，因“性特征異常3個月余”于2020年11月12日就診我院，以“兩性畸形”收住入院?；純焊改赣谌朐呵? 個月發(fā)現(xiàn)患兒下腹部橢圓形包塊，伴反復(fù)多次嵌頓，無惡心、嘔吐，無腹痛、腹脹、腹瀉。于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行“剖腹探查術(shù)”，術(shù)中發(fā)現(xiàn)雙側(cè)鞘突均未閉合，雙側(cè)“子宮圓韌帶”近內(nèi)環(huán)口約1 cm 處分別可見約1 cm 直徑腫物，質(zhì)中，進一步行“腹腔鏡探查+雙側(cè)腹股溝區(qū)腫物切除活檢+雙側(cè)腹股溝斜疝疝囊高位結(jié)扎術(shù)”，術(shù)后患兒恢復(fù)良好。雙側(cè)腹股溝腫物病理檢查顯示：纖維組織內(nèi)可見較多小管狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)學(xué)似曲細精管，呈結(jié)節(jié)狀排列，周圍可見大量后壁血管，病理診斷為：兩性畸形？。染色體檢查結(jié)果顯示，患兒染色體核型為“46，XY”。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為雙側(cè)腹股溝斜疝、兩性畸形。為進一步診治轉(zhuǎn)至我院?；純喊l(fā)病以來精神食欲良好，既往體健否認高血壓史。父母體健，非近親結(jié)婚，無相關(guān)遺傳病家族史。入院體格檢查：血壓：111/55 mmHg，全身膚色略深，雙側(cè)乳腺未發(fā)育，青春期發(fā)育Tanner分期Ⅰ期，外陰口呈幼女型，無陰毛，外陰無色素沉著，可見陰道口。生長發(fā)育評估：身高105 cm，體質(zhì)量17.5 kg，均處于生長曲線第97百分位數(shù)，智力發(fā)育在正常范圍內(nèi)。輔助檢查結(jié)果為電解質(zhì)：血鉀4.01 mmol/L，血鈉141 mmol/L，血氯109 mmol/L，血鈣2.4 mmol/L，無機磷1.71 mmol/L，血鎂0.79 mmol/L。激素檢測結(jié)果為：血清類胰島素生長因子-1（IGF-1）99.7 ng/mL、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3（IGFBP3）4.64 μg/mL、4pM 皮質(zhì)醇（Cor）1.16 μg/mL、8AM 促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）分別為44.6 ng/mL、黃體生成素（LH）0.42 mIU/mL、卵泡刺激素（FSH）27.92 mIU/mL、雌二醇（E2）＜10.00 pg/mL、脫氫表雄酮（DHEA）＜15.0 μg/dL、孕酮（P）1.7ng/mL、睪酮（TT）1.37 ng/mL、泌乳素（PRL）15.2 ng/mL，雄烯二酮（A4）＜0.300 ng/mL、尿游離皮質(zhì)醇（UFC）21.56 μg/24 h、24 h 尿17 羥類固醇（17-OHCS）1.83 mg/24 h、24 h 尿17-酮類固醇（17-KS）0.39 mg/24 h、17α 羥孕酮（17α-OHP）0.07 ng/mL、腎素（Renin）＜0.50 ng/L、醛固酮（ALD）85.01 ng/L。左側(cè)手部X 線骨齡評估：骨齡與實際年齡大致相符；雙側(cè)腎上腺彩超：雙側(cè)腎上腺未見明顯異常；婦科B超檢查未探及子宮及雙側(cè)卵巢。

1.2 患兒及其家系全基因組檢測 ①提取外周血基因組DNA：簽署知情同意書后，抽取患兒、哥哥及其父母外周血各8 mL，以EDTA K2抗凝，將外周血送上海瀚垚生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。采用TIANamp Micro DNA 提取試劑盒（DP316，天根生化科技有限公司，中國）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序操作提取患兒及其他家庭成員基因組DNA。②PCR 擴增基因組DNA：通過降解、環(huán)化將DNA 轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)狀DNA 后對其進行末端修復(fù)，PCR 擴增構(gòu)建DNA 文庫。DNA 文庫與捕獲的Capture Library 雜交，使用Dynabeads?MyoneTMStreptavidin T1 捕獲雜交DNA，同時用PCR 擴增捕獲文庫，并使用Q-PCR 文庫進行質(zhì)檢。③基因組DNA 測序分析：將DNA 文庫上樣到流動槽然后置于測序儀中，使用Illumina 測序儀器進行測序。Illumina測序儀器使用檢測拷貝數(shù)芯片，可檢測出染色體非整倍體以及100 kb以上基因組拷貝變異［4］。運用BWA 軟件比對到參考基因組上（hg19 版本），對測序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用GATK 軟件對這個樣本的比對數(shù)據(jù)進行多態(tài)性位點的檢測，對單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入缺失突變（InDels）等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，查找SNPs 及InDels 在千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、Ex-AC_EAS及邁基諾內(nèi)部1000正常漢族人群數(shù)據(jù)庫頻率，利用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++等數(shù)據(jù)庫對SNPs及InDels 的致病性進行預(yù)測分析，篩選千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、Ex-AC_EAS及邁基諾內(nèi)部1000正常漢族人群數(shù)據(jù)庫中頻率＜0.05 且預(yù)測結(jié)果均為致病性的位點作為疾病相關(guān)位點。

2 結(jié)果

患兒10 號染色體CYP17A1 基因第6 外顯子存在c.987delC 純合錯義突變（p.Tyr329fs），即CYP17A1 基因第987 位缺失C，導(dǎo)致氨基酸合成時329 位酪氨酸移碼突變。見圖1?；純焊绺绾透改付即嬖赾.987delC 雜合錯義突變（p.Tyr329fs），見圖2～4。患兒家系突變分析表明患兒攜帶的CYP17A1基因突變分別來源于父母，見圖5。

圖1 患兒10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖2 患兒父親10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖3 患兒母親10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖4 患兒哥哥10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖5 17 OHD患兒的遺傳家系圖

3 討論

17OHD 的發(fā)病率為1∶50 000～100 000［5］。17OHD是由于CYP17A1基因突變引起，該基因主要在腎上腺和性腺中表達，定位于10q24.32，包含8個外顯子和7 個內(nèi)含子，基因全長6.6 kb，其編碼的細胞色素P450催化許多藥物代謝以及膽固醇、類固醇和其他脂類合成，是激素合成途徑中產(chǎn)生黃體酮、鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、雄激素和雌激素的關(guān)鍵酶［6-7］。CYP17A1 基因變異類型較多，人類基因突變數(shù)據(jù)庫中已報道100 多例，包括錯義突變、無義突變、缺失突變、插入突變、剪接突變等［8-9］。迄今為止，外顯子6 的P.H373L、P.Y329fs 突變和外顯子8的D487_F489 突變是中國人CYP17A1 基因最常見的突變，該突變在日本、泰國、韓國等亞洲國家均有報道，可能是一種亞洲人群的“祖先效應(yīng)”，即不同的種族CYP17A1 基因突變不同［9～12］。本例患兒檢測到10 號染色體CYP17A1 基因第6 外顯子存在c.987delC 純合錯義突變p.Tyr329fs，分別來自父親和母親的雜合基因突變，為中國人群CYP17A1 基因常見突變類型。

CYP17A1 基因調(diào)控17-α 羥化酶/17，20-裂解酶合成，這種酶在類固醇激素的合成中起到以下兩種作用：①17-羥基化反應(yīng)可催化孕烯酮醇和孕酮羥化，若此酶缺乏可導(dǎo)致DOC、皮質(zhì)酮和18-羥皮質(zhì)酮生成增加，上述激素具有鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素樣作用，可代償患者皮質(zhì)醇不足，患者出生后無腎上腺皮質(zhì)不足表現(xiàn)，但過度代償時，鹽皮質(zhì)激素樣作用導(dǎo)致患者出現(xiàn)低腎素性高血壓，低血鉀表現(xiàn)。②17，20-裂解反應(yīng)可催化17 羥孕烯酮醇和17 羥孕酮裂解，最終生成性激素，該酶缺乏導(dǎo)致性激素合成不足，引起性腺幼稚、第二性征缺如等［13］。本例患兒表現(xiàn)為低腎素、皮質(zhì)醇、17-羥孕酮、UFC、DHEA、TT、E2 和A4，高FSH，ALD 正常。17-OHCS 和17-KS 降低提示患者腎上腺皮質(zhì)功能處于較低狀態(tài)，患兒ALD 正?？赡芤驗樗蜋z標(biāo)本中含有醛固酮前體皮質(zhì)酮，另一種可能是患者體內(nèi)殘存17OHD，這與SUN 等［14］報道的醛固酮正常患者相似。MACKENZIE 等［15］認為CYP17A1基因可能通過共同的調(diào)節(jié)因子影響醛固酮水平，YAMAKITA 等［16］認為醛固酮水平與基因受損程度相關(guān)［15-16］。另外，通過文獻檢索未發(fā)現(xiàn)LH 降低的患者，因此需根據(jù)患兒的年齡和性別判斷LH水平。

17OHD 典型臨床表現(xiàn)為低腎素性高血壓，低鉀血癥，男性假兩性畸形和女性性幼稚，雄激素水平低，黃體生成素、卵泡刺激素增高［17］。CYP17A1 基因的缺陷可分為完全性聯(lián)合缺陷型17OHD、部分性聯(lián)合缺陷型17OHD（非經(jīng)典型）和孤立性17，20-碳鏈裂解酶缺陷癥（isolated 17，20-lyase deficiency，ILD），部分性聯(lián)合缺陷型17OHD 患者17-α 羥化酶/17，20-裂解酶缺乏程度輕于完全性聯(lián)合缺陷型17OHD 患者，因此前者臨床癥狀也較后者輕［18］。完全性聯(lián)合缺陷型17OHD 患者最常見，46，XX 患者表現(xiàn)為第二性征不發(fā)育、原發(fā)閉經(jīng)、幼稚子宮等，46，XY 患者表現(xiàn)為假兩性畸形、外生殖器女性化、腹腔或腹股溝區(qū)睪丸、子宮和卵巢缺如。完全性聯(lián)合缺陷型17OHD 患者均有高血壓、低血鉀等典型臨床表現(xiàn)，但有研究表明，10%～15%患者可表現(xiàn)為血壓正常［9，19-20］。部分性聯(lián)合缺陷型17OHD 患者因有少量性激素產(chǎn)生，因此46，XX 患者常表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、經(jīng)期不規(guī)律、繼發(fā)性閉經(jīng)、不同程度乳腺發(fā)育和陰毛生長，46，XY 患者表現(xiàn)為不完全男性化、陰毛稀少、假兩性畸形［21-22］。ILD 患者保留17-α 羥化酶活性，但17，20-裂解酶活性缺乏，因此表現(xiàn)為尿道下裂、小陰莖、陰囊對裂，血壓、血鉀正常［23］。綜上所述，本例患兒的臨床表現(xiàn)提示患兒屬于完全性聯(lián)合缺陷型17OHD?；純鹤畛醣徽`診為“雙側(cè)腹股溝斜疝”，這是由于46，XY 型患者胚胎期分泌苗勒管激素，導(dǎo)致副中腎管退化，出生后內(nèi)生殖器男性化，但睪丸常位于腹腔或腹股溝，外生殖器女性化，但陰道常為盲短［24］?；诖?，患兒一般診斷較早?；純浩渌R床表型如外生殖器女性化、無子宮、無輸卵管等，均符合17OHD 臨床表現(xiàn)［25］。本例患兒并未出現(xiàn)高血壓和低血鉀，生長發(fā)育處于正常水平，且未見腎上腺增生，與一例韓國病例報道［20］中患兒僅表現(xiàn)為血壓、血鉀正常一致。

目前各種精確的分子遺傳學(xué)檢測已被用于17OHD 的診斷，大多數(shù)患者在青春期被確診，部分輕中度表型通常在中老年被確診。其中二代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）的使用，使得大量的單基因和多基因遺傳性疾病明確診斷。NGS技術(shù)具有高通量、速度快、精度高、信息量豐富等優(yōu)勢，是目前17OHD 最主要的診斷技術(shù)之一。但不同的測序方法在基因檢測數(shù)目、數(shù)據(jù)分析速度、檢測成本等方面有很大的差異，因此合適的檢測方法不僅為臨床醫(yī)師迅速診斷提供遺傳學(xué)依據(jù)的同時還可以降低患者診治成本。

17OHD 的治療主要以糖皮質(zhì)激素替代治療以及對癥治療為主。糖皮質(zhì)激素主要作用是抑制ACTH，改善雄激素水平，降低DOC 水平。糖皮質(zhì)激素替代治療可選擇地塞米松、潑尼松和氫化可的松，其中氫化可的松屬于生理性糖皮質(zhì)激素，具有一定水鈉潴留作用（鹽皮質(zhì)激素樣作用），因此臨床應(yīng)用更廣泛［26-29］。為了患兒心理健康應(yīng)盡早確認性別，早期藥物治療可改變性激素水平。我們給予患兒醋酸潑尼松2.5 mg/晚口服，使患兒獲得正常青春期發(fā)育。但人工激素?zé)o法替代生理性脈沖分泌及晝夜節(jié)律，因此定期隨訪和檢查激素變化對17OHD 患兒的預(yù)后至關(guān)重要。3 個月治療后患兒血清8AM 的ACTH 43.9 ng/mL、4pM 的ACTH 65.1 ng/mL、LH1.2mIU/mL、FSH 35.9 mIU/mL、E2＜5.00 pg/mL、TT＜2.5 ng/mL、PRL 24.9 ng/mL，提示患兒仍存在低皮質(zhì)醇、低性腺激素、高促性腺激素，調(diào)整為醋酸潑尼松5 mg/口服，將繼續(xù)對患兒進行隨訪。此外研究［30］發(fā)現(xiàn)，46，XY 患者常在腹腔或腹股溝區(qū)發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常的異位睪丸，極易發(fā)生惡變，因此需要手術(shù)切除異位睪丸。本例患兒于外院誤診為“雙側(cè)腹股溝斜疝”，雙側(cè)異位睪丸已行手術(shù)切除，同時我們建議患兒父母針對患兒外生殖器假兩性畸形可考慮手術(shù)矯正。

綜上所述，17OHD 患兒存在10 號染色體CYP17A1 基因第6 外顯子c.987delC（p.Tyr329fs）純合突變，其父母、哥哥均為10 號染色體CYP17A1基因第6 外顯子c.987delC（p.Tyr329fs）雜合突變。17OHD 患兒的外顯子突變來自父母遺傳。17OHD是一類較為罕見的CAH 典型表現(xiàn)為低腎素性高血壓、低鉀血癥、性腺功能異常等，部分患者臨床表現(xiàn)不典型易造成誤診、漏診，臨床診療過程中應(yīng)從臨床表現(xiàn)、輔助檢查及基因檢測等方面綜合診斷。