阿密茴素拮抗多柔比星組織毒性及其機制研究

周文娟， 王玓玥， 趙淼淼， 劉 巖

(四川大學生命科學學院， 成都 610065)

多柔比星(DOX)是蒽環(huán)家族中使用最廣泛的化療藥物，被用于治療急性白血病(淋巴細胞性和粒細胞性)、胃癌、肝癌等[1,2].

DOX被大量用于癌癥治療，但其在臨床使用中會導致患者發(fā)生不同程度的心臟、肝臟、腎臟、血液損傷[3，4].臨床數(shù)據(jù)表明，病人在DOX治療過程中會出現(xiàn)心臟毒性的癥狀，例如心率不齊、血壓偏低、心電圖紊亂等[5，6]；另外還有病人會出現(xiàn)肝毒性，例如膽管畸形增生、組織內(nèi)病灶壞死等[7，8]；除此之外，腎損傷現(xiàn)象也不可忽視，比如腎上皮細胞的退化進而引起腎小球惡化，最終導致腎小球硬化(腎病的標志之一)，腎小管擴張、間質纖維化和炎癥、蛋白尿、局灶性腎小球硬化等[9-11].目前為止，右丙亞胺(Dexrazoxane，DZR)是唯一被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準用于緩解蒽環(huán)化療藥誘發(fā)的心臟毒副作用的藥物.但遺憾的是，此藥不僅會影響化療藥的抗腫瘤效果，還有誘發(fā)二次癌癥的風險.因此DZR在歐洲被禁止使用，在美國也僅限于特定的癌癥治療[12].基于此種情況，開發(fā)一種安全有效的佐劑具有重要意義.

本實驗室前期利用DOX誘導產(chǎn)生心臟毒性的斑馬魚模型，篩選出以阿密茴素(VIS)為代表的化學小分子，發(fā)現(xiàn)VIS在小鼠和斑馬魚模型中均可減弱DOX誘發(fā)的心臟毒性，并且不會影響其抗腫瘤效果[13].VIS是一種從Ammivisnaga植物中提取的具有生物活性的化學小分子，屬于γ-吡喃酮類化合物.在一些亞洲國家的古代藥典中，VIS被用于腎結石、心絞痛等疾病的治療，同時現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)VIS具有舒緩平滑肌、降低血壓、消炎的作用[14].

已有報道表明，DOX可通過穩(wěn)定TOP2-DNA共價復合物致使細胞死亡：TOP2是細胞內(nèi)高度保守的酶，在DNA復制、轉錄時負責切斷并且重連DNA，釋放超螺旋引起的張力[15].DOX存在時會穩(wěn)定TOP2-DNA共價復合物結構，當細胞清除該復合物時會暴露出自由DNA末端，從而造成雙鏈DNA斷裂(double-strand DNA break；DSB)甚至細胞死亡[16].這一發(fā)現(xiàn)將為DOX佐劑的機制研究提供線索.

為了探究VIS是否可以保護其他組織器官及其保護機制，本課題通過構建DOX誘導產(chǎn)生肝、腎毒性的小鼠急/慢性模型，證實VIS對小鼠肝、腎損傷具有緩解作用；擬通過機制研究實驗結果揭示VIS是否通過抑制TOP2-DNA共價復合物的形成發(fā)揮保護作用.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗動物 Balb/c小鼠購于達碩公司(成都，四川)，均為6～8周齡，雄性，體重20±2 g，嚴格按照SPF級飼養(yǎng)標準飼養(yǎng).

2.1.2 主要試劑 環(huán)糊精、DOX、VIS、阿佛丁均購于Innochem.

2.2 實驗方法

2.2.1 小鼠實驗 本實驗所有小鼠飼養(yǎng)條件嚴格按照SPF級飼養(yǎng)標準，購回適應24 h以上再開展實驗.

急性模型：適應環(huán)境后的小鼠隨機分為Cont(對照)組、DOX(阿柔比星)組、DV(阿柔比星/VIS共處理)組,每組5只.對照組尾靜脈注入20 mg/kg生理鹽水及25 mg/kg環(huán)糊精溶液；DOX組尾靜脈注入20 mg/kg DOX溶液及25 mg/kg環(huán)糊精溶液；DV組尾靜脈注射20 mg/kg的DOX溶液以及25 mg/kg VIS溶液.給藥24 h后麻醉小鼠收取肝組織及腎組織，并及時將組織置于4%甲醛中過夜固定.

慢性模型：15只小鼠隨機分為Cont、DOX、DV組，每組5只.對照組尾靜脈注入5 mg/kg生理鹽水及25 mg/kg環(huán)糊精溶液，1 w 2次，連續(xù)注射2 w.DOX組尾靜脈注入5 mg/kg DOX溶液及25 mg/kg環(huán)糊精溶液，1 w 2次，連續(xù)注射2 w.DV組尾靜脈注入5 mg/kg DOX溶液及25 mg/kg VIS溶液，1 w 2次，連續(xù)注射2 w.給藥結束后麻醉小鼠，眼球采取300 μL全血用于檢測肝腎功能，肝腎組織用4%甲醛固定.

VIS安全性檢測實驗：隨機將10只小鼠分為Cont組和VIS組，每組5只.對照組尾靜脈注入25 mg/kg的40% 環(huán)糊精溶液，VIS組尾靜脈注入25 mg/kg VIS溶液.1 w注射2次，持續(xù)2 w，注射安排及小鼠取樣同上述慢性小鼠模型一致.

2.2.2 生化指標測定 小鼠血液送至成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司(成都，四川)，做血液生化指標測定.

2.2.3 組織凋亡細胞檢測 固定好的肝腎組織脫水包埋后進行TUNEL染色.在萊卡DM6B熒光顯微鏡下拍取照片，Image J軟件計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，TUNEL/總細胞數(shù)比值為組織細胞凋亡比例.

2.2.4 RADAR實驗 稱取10 mg小鼠新鮮組織，使用2 mL M裂解液充分研磨.通過乙醇沉淀法去除DNA中的雜質，取相同量的DNA吸附于硝酸纖維膜上，孵育TOP2抗體檢測TOP2-DNA共價復合物的形成情況.

2.2.5 統(tǒng)計分析 結果使用Prism軟件進行t檢驗分析.每次獨立實驗的數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差表示;***，P<0.001;**，P<0.01;*，P<0.1.

3 結果與分析

3.1 VIS減少急性小鼠模型中肝細胞和腎細胞死亡

小鼠被隨機分為對照組(Cont)、DOX組、DV(DOX/VIS共處理)組.給藥24 h后，收取小鼠的肝腎組織制作成石蠟切片進行TUNEL染色，計數(shù)TUNEL陽性(凋亡細胞)占總細胞比例.結果如圖1所示:和對照組小鼠相比，DOX處理會導致小鼠肝組織和腎組織細胞凋亡率顯著上升，同時VIS將DOX升高的細胞凋亡率降低到對照組水平，這說明VIS對DOX誘發(fā)的肝細胞和腎細胞凋亡具有顯著保護作用.

圖1 VIS減少DOX急性給藥引起的肝組織和腎組織細胞凋亡

3.2 VIS減少慢性小鼠模型中肝細胞和腎細胞的凋亡

我們構建了為期14 d的DOX慢性小鼠模型(圖2a)，給藥結束后，收取肝、腎組織制作切片，TUNEL染色并計算細胞凋亡率.統(tǒng)計每組5只小鼠的數(shù)據(jù)，結果如圖2b，2c所示：在DOX組小鼠中，凋亡細胞比例明顯上調(diào)，而VIS可以將細胞凋亡率降低到對照組水平，顯著減少細胞凋亡.這表明同急性小鼠結果一致，VIS可以有效緩解DOX慢性給藥造成的肝、腎細胞毒性.

3.3 VIS緩解DOX誘發(fā)的肝功能和腎功能損傷

在圖2a實驗的終點，我們收集了小鼠血液進行生化指標檢測.實驗結果如圖3所示：與對照組相比，注射DOX的小鼠血漿中肝功能指標(AST、ALT)、腎功能指標(BUN、CREA)水平均顯著上升，意味著DOX損害了小鼠肝、腎功能，而VIS共處理則有效地將AST、ALT、BUN、CREA水平均降低到對照組水平，揭示VIS可以顯著改善DOX誘發(fā)的肝、腎功能損傷.由此進一步驗證VIS除了可以拮抗DOX誘導的肝、腎細胞凋亡外，還可以維持肝、腎的正常功能.

圖2 VIS減少DOX慢性給藥引起的肝組織和腎組織細胞凋亡

3.4 VIS拮抗DOX引起的小鼠體重減輕

在實驗過程中我們還發(fā)現(xiàn)VIS對小鼠的生存狀態(tài)具有顯著的改善作用.在上述14 d小鼠慢性模型中，我們選取第1、5、8、12、14 d稱取小鼠體重，統(tǒng)計結果如圖4所示：對照組小鼠的平均體重14 d內(nèi)穩(wěn)步上升，DOX組小鼠的體重則顯著減輕，毛色暗淡，運動遲緩，而注射VIS則可以有效提升小鼠的體重及其生存狀態(tài).

圖3 VIS緩解DOX引起的肝腎功能損傷

3.5 VIS無肝毒性和腎毒性

采用上述慢性給藥方式處理小鼠，設置對照組和VIS組，其中對照組注射40%環(huán)糊精溶液，VIS組小鼠只注射VIS溶液(VIS溶解于40%環(huán)糊精中).待給藥完成后，抽取血液測肝、腎功能指標，統(tǒng)計結果如5所示：和對照組相比，VIS組小鼠的肝功能指標AST、ALT和腎功能指標BUN、CREA均無顯著的變化，由此可說明VIS對小鼠肝、腎組織均無毒性，是一種潛在的安全用藥.

圖4 VIS緩解DOX引起的小鼠體重減輕

圖5 VIS無肝毒性和腎毒性(a) 肝組織； (b) 腎組織Fig.5 VIS is free of liver and kidney toxicity(a) Liver statistics； (b) kidneystatistics

3.6 VIS抑制小鼠肝腎組織中DOX誘發(fā)的TOP2-DNA共價復合物形成

使用急性模型小鼠的肝、腎組織樣品進行DNA復合物快速檢測(RADAR)實驗.RADAR實驗原理主要是通過強裂解液去除掉DNA上非共價結合的TOP2蛋白，僅留下共價結合的TOP2蛋白，量取等量DNA吸附于硝酸纖維膜并孵育TOP2抗體，由此便可以通過TOP2信號強弱反映TOP2-DNA共價復合物的濃度.結果如圖6a，6c所示：DOX組小鼠肝、腎組織內(nèi)TOP2-DNA共價復合物水平顯著升高，而DV處理組小鼠肝、腎內(nèi)TOP2-DNA復合物水平則明顯降低.三次獨立實驗結果統(tǒng)計如圖6b,6d：VIS阻礙了DOX誘發(fā)的肝腎組織內(nèi)TOP2-DNA共價復合物形成.已有報道表明，DOX可通過穩(wěn)定TOP2-DNA共價復合物致使細胞死亡[14].以上數(shù)據(jù)支持VIS在小鼠體內(nèi)通過抑制TOP2-DNA共價復合物形成發(fā)揮保護作用.

圖6 VIS抑制小鼠組織內(nèi)TOP2-DNA共價復合物形成

4 討 論

DOX是臨床上應用最廣的化療藥之一，但其組織器官毒性極大限制了治療效果[1].其中DOX誘發(fā)的劑量依賴性心臟毒性尤為嚴重，除此之外肝腎毒性也不可小覷[6,7].本實驗室前期采用DOX誘導產(chǎn)生心臟毒性的斑馬魚模型，篩選出以VIS為代表的化學小分子，發(fā)現(xiàn)VIS在小鼠和斑馬魚模型中均可以減弱DOX誘發(fā)的心臟毒性，并且不會干擾DOX治療癌癥的效果.但VIS是否可以保護肝腎組織尚不知曉.為了模擬臨床上DOX的給藥方式，明確VIS對DOX誘發(fā)的肝腎毒性是否具有緩解作用，我們使用急性和慢性小鼠肝腎損傷模型，通過比較VIS處理后的各項指標變化評價其肝腎損傷程度.結果表明VIS可以有效減少DOX引起的肝腎組織細胞凋亡，并且緩解DOX造成的肝腎功能損傷.

細胞實驗結果表明，達到相同的細胞保護作用，VIS所需濃度遠遠小于DZR：DOX處理細胞死亡率高達30%，而25 μmol/L的VIS溶液和100 μmol/L的DZR均可將細胞死亡率降低至5%，這也許暗示了VIS和DZR的作用機制及作用效力不同[17].

近年來越來越多的研究支持DOX可通過TOP2通路誘發(fā)組織毒性，特別是在心肌細胞中特異性敲除TOP2b后，小鼠心臟表現(xiàn)出了對DOX極大的抗性.TOP2負責釋放DNA轉錄和復制時產(chǎn)生的超螺旋張力，DOX可以通過穩(wěn)定TOP2催化過程中的中間產(chǎn)物TOP2-DNA共價復合物，從而引起DNA損傷及細胞死亡[14,15].我們的研究支持VIS通過抑制TOP2-DNA共價復合物形成拮抗DOX誘導的組織器官毒性.

綜上，本研究結果揭示了VIS是一種可以有效拮抗DOX毒副作用的潛在安全佐劑，通過作用于TOP2蛋白發(fā)揮保護作用，但其具體作用機制還有待進一步的研究.