動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化過程中全轉(zhuǎn)錄組3′-UTR動(dòng)態(tài)變化研究

杜志強(qiáng)，趙素娟，陳耀峰，丁 然，殷宗俊，楊彩俠

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，合肥 230036）

動(dòng)物脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞構(gòu)成，通過儲(chǔ)存能量和執(zhí)行內(nèi)分泌功能影響新陳代謝，參與調(diào)控動(dòng)物健康和肉品品質(zhì)[1]。脂肪生成關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）是最主要的兩類調(diào)控因子[2]。不同部位脂肪組織生理生化特性不同，糖利用、脂代謝機(jī)制和激素敏感性也存在差異，如肌內(nèi)脂肪含量是影響肉質(zhì)重要因素，腹部脂肪含量影響屠宰效率、皮下白色脂肪組織，發(fā)揮儲(chǔ)存脂肪和抗炎作用等[3]。

比較分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物（人和小鼠）脂肪細(xì)胞系和家禽前脂肪細(xì)胞分化存在異同。與哺乳動(dòng)物相比，禽類脂肪細(xì)胞分化同樣受到PPARγ與C/EBPα等因子影響，但其表達(dá)模式及調(diào)控作用均有差異。C/EBPα和PPARγ發(fā)揮啟動(dòng)禽類前脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵作用，且C/EBPα調(diào)控PPARγ轉(zhuǎn)錄活性，而PPARγ對(duì)C/EBPα表達(dá)無直接調(diào)控作用[4]。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）一般在哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化中晚期高表達(dá)，在雞脂肪細(xì)胞分化早期表達(dá)量明顯上升，比C/EBPα等基因更早表達(dá)[5]。近年來，在深入研究和比較不同動(dòng)物脂肪生成分子機(jī)制上，轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)眾多關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路[6-9]。

真核生物有多種mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，其中mRNA 3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）參與發(fā)揮重要作用。前體mRNA成熟過程中，3′-UTR發(fā)生剪切和多聚腺苷酸化反應(yīng)，而不同多聚腺苷酸化位點(diǎn)選擇，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體具有不同3′-UTR長度和序列組成[10]。3′-UTR長度變化導(dǎo)致丟失或獲得順式作用元件，如富含AU序列元件（ARE），富含GU序列元件（GRE）等，可被microRNA、RNA結(jié)合蛋白（RBP）等反式作用因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控mRNA亞細(xì)胞定位、穩(wěn)定性及翻譯效率[11]。因此，3′-UTR具有以下主要功能：通過順式作用元件調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性；調(diào)控mRNA定位表達(dá)和翻譯；結(jié)合多個(gè)RBP行使調(diào)控功能；調(diào)控蛋白-蛋白相互作用[11-12]。

隨3′-UTR功能研究深入，發(fā)現(xiàn)其與動(dòng)物生產(chǎn)性能關(guān)系密切。首先，運(yùn)用候選基因法，即挑選功能已知相關(guān)基因，通過生物信息學(xué)分析、關(guān)聯(lián)性分析和構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)等方法，檢測3′-UTR同性狀關(guān)聯(lián)。Bartz等發(fā)現(xiàn)ME1基因3′-UTR中有7個(gè)新變異，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與波蘭長白豬和大白豬背膘厚度和平均日增重顯著相關(guān)[13]。其次，通過分析microRNA與其靶mRNA 3′-UTR序列互補(bǔ)配對(duì)，可探究3′-UTR如何影響基因表達(dá)。Li等發(fā)現(xiàn)，miRNA-122可靶向于Vanin 1基因3′-UTR，調(diào)控Vanin 1表達(dá)，影響雞肝臟脂質(zhì)代謝過程[14]。但前脂肪細(xì)胞分化過程中是否存在3′-UTR動(dòng)態(tài)變化，目前還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過使用Dapars和APAtrap兩個(gè)選擇性多聚腺苷酸化（APA）預(yù)測軟件，分析四種動(dòng)物（雞、鴨、豬和小鼠）不同分化時(shí)期前脂肪細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，探究脂肪生成過程中轉(zhuǎn)錄組水平上3′-UTR長度存在動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。研究將有助于理解動(dòng)物前脂肪細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為動(dòng)物脂肪生長發(fā)育生物學(xué)機(jī)制研究提供新視角。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

本研究使用4個(gè)不同動(dòng)物前脂肪細(xì)胞不同分化時(shí)期4套轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)集，包括京海黃雞肌肉內(nèi)脂肪、北京鴨皮下脂肪和長白豬皮下脂肪來源的前脂肪細(xì)胞，以及小鼠3T3-L1細(xì)胞[7-9]。數(shù)據(jù)均從國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）短序列檔案（SRA）數(shù)據(jù)庫中下載，SRA號(hào)分別為SRX2037700（雞）、SRX4646736（鴨）、SRX5121442（豬）和SRX345947（鼠）。京海黃雞有12個(gè)樣本，分別在前脂肪細(xì)胞分化0、2、4、6 d進(jìn)行測序（記為I0、I2、I4和I6），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)；北京鴨36個(gè)樣本分別在前脂肪細(xì)胞分化-48、0、12、24、48、72 h進(jìn)行測序(記為T-48、T0、T12、T24、T48和T72），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6個(gè)重復(fù)；長白豬共12個(gè)樣本，分別在前脂肪細(xì)胞分化0、2、4、8天進(jìn)行測序（記為I0、I2、I4和I8），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)；3T3-L1細(xì)胞測序8個(gè)樣本，時(shí)間點(diǎn)分別為3T3-L1細(xì)胞指數(shù)擴(kuò)散期、48 h融合期、誘導(dǎo)分化10 h和第6天（記為EP、C、T10 h和T6 d），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2個(gè)重復(fù)。

1.2 生物信息學(xué)分析

4套R(shí)NA-seq數(shù)據(jù)通過fastqc網(wǎng)址控制質(zhì)量。將clean reads通過HISAT2[7]比對(duì)到參考基因組（Gallus_gallus.GRCg6a（雞）；Anas_platyrhynchos_platyrhynchos.CAU_duck1.0（鴨）；Sus_scrofa.Sscrofa 11.1（豬）；GCF_000001635.27_GRCm39_genomic.fna（小鼠）。最后，使用samtools將sam文件處理成bam文件，使用featureCounts計(jì)算基因的表達(dá)量。

1.3 全轉(zhuǎn)錄組水平3′-UTR長度差異分析

Dapars（Dynamic Analyses of Alternative PolyAdenylation from RNA-Seq，version 0.9.1)通過比較RNA-seq數(shù)據(jù)推斷APA位點(diǎn)[15]。Dapars將注釋的3′-UTR末端作為遠(yuǎn)端poly（A）位點(diǎn)，據(jù)此預(yù)測其上游近端poly（A）位點(diǎn)，推斷APA差異使用。因此，通過比較RNA-seq數(shù)據(jù)，Dapars可推斷出APA起始位置，長或短3′-UTR轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平，從而確定APA動(dòng)態(tài)用法。轉(zhuǎn)錄本應(yīng)用APA的情況，可通過比較兩組數(shù)據(jù)之間PDUI變化預(yù)測：PDUI_Group_diff值為正，應(yīng)用近端poly（A）位點(diǎn)（對(duì)應(yīng)短3′-UTR）；PDUI_Group_diff值為負(fù)，應(yīng)用遠(yuǎn)端poly（A）位點(diǎn)（對(duì)應(yīng)長3′-UTR）。

APAtrap也可從RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定和量化poly（A）位點(diǎn)，鑒定不同條件下具有顯著APA動(dòng)態(tài)使用的基因[16]。APAtrap識(shí)別新的或延長3′-UTR，并精確預(yù)測所有潛在poly（A）位點(diǎn)。APAtrap可通過整合一個(gè)基因中所有poly（A）位點(diǎn)位置和表達(dá)水平，探索不同使用模式APA事件。通過比較兩組數(shù)據(jù)之間r變化，預(yù)測轉(zhuǎn)錄本應(yīng)用APA的情況：r值為正，則應(yīng)用近端poly（A）位點(diǎn)（對(duì)應(yīng)短3′-UTR）；r值為負(fù)，則應(yīng)用遠(yuǎn)端poly（A）位點(diǎn)（對(duì)應(yīng)長3′-UTR）。

使用Dapars分析時(shí)，PDUI參數(shù)設(shè)為0.25，其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，按照adjusted.P_val＜0.05和Pass_Filter=Y進(jìn)行篩選；使用APAtrap分析時(shí)，所有參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，按照adjusted P-value＜0.05和PD≥0.2篩選。

1.4 基因表達(dá)水平和3′-UTR長度差異分析

利用DEseq2軟件包分析由featureCounts計(jì)算得到的counts矩陣，根據(jù)|log2FC|＞0.5，padj＜0.05篩選得到差異表達(dá)基因（命名為DE-exp）。3′-UTR長度有顯著差異基因稱為DE-3′-UTR基因（Dapars，|PDUI_Group_diff|＞0.25和adjusted.P_val＜0.05；APAtrap，|perc_diff|≥0.2和adjusted P-value＜0.05）。

1.5 功能富集分析

對(duì)表達(dá)水平和3′-UTR長度有顯著差異基因（DE-exp基因和DE-3′-UTR基因）進(jìn)行Gene Ontology（GO）功能注釋和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析。GO富集結(jié)果包括3部分：分子功能（Molecular function，MF）、生物過程（Biological process,BP）和細(xì)胞組成（Cellular component，CC）。每部分富集結(jié)果（P＜0.05）僅在圖中展示前5個(gè)（不足5個(gè)的全部展示），并列出富集條目較多的生物過程和與脂肪生成相關(guān)的生物過程。此外，P＜0.05的生物功能和信號(hào)通路被認(rèn)為顯著富集，并繪制成KEGG氣泡圖。

1.6 microRNA調(diào)控分析

3′-UTR長短不同，導(dǎo)致其序列成分存在差異，影響其功能調(diào)控，如microRNAs同3′-UTR結(jié)合與否，通常影響翻譯抑制、蛋白表達(dá)降低和/或轉(zhuǎn)錄本降解[17]。通過TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）和miRbase數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org/search.shtml）確定和分析靶向DE-3′-UTR基因microRNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)初步分析

4種動(dòng)物RNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)和質(zhì)量控制結(jié)果如下：京海黃雞12個(gè)測序文庫，共產(chǎn)生1 382 347 320的原始短序列（rawreads），質(zhì)控后獲得1 328 693 812的clean reads（每個(gè)文庫比例：95.81%~96.52%）；clean reads比對(duì)率，78.62%~92.64%。北京鴨36個(gè)測序文庫，1 908 767 014 raw reads，質(zhì)控后獲得1 855 198 888的clean reads（每個(gè)文庫比例：95.96%~97.78%）；clean reads比對(duì)率，69.23%~79.72%。長白豬12個(gè)測序文庫，382 731 382 raw reads，質(zhì)控后獲得375 439 840的clean reads（每個(gè)文庫比例：97.52%~98.37%）；clean reads比對(duì)率，96.40%~96.97%；3T3-L1細(xì)胞8個(gè)測序文庫，共產(chǎn)生1 579 675 811 raw reads，質(zhì)控后獲1 434 061 091的clean reads（每個(gè)文庫比例：85.91%~95.94%）；clean reads比對(duì)率，91.91%-97.42%。

2.2 前脂肪細(xì)胞分化過程中3′-UTR的長度動(dòng)態(tài)變化

使用Dapars和APAtrap兩個(gè)軟件分析RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)前脂肪細(xì)胞不同分化時(shí)期進(jìn)行兩兩比較，尋找有3′-UTR差異基因，并分析其長度動(dòng)態(tài)變化。

2.2.1 京海黃雞

分析京海黃雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，Dapars分別得到352、440和111個(gè)DE-3′-UTR基因（I0vsI2、I2vsI4、I4vsI6），APAtrap分別得到1 378、1 411和357個(gè)DE-3′-UTR基因（I0vsI2、I2vsI4、I4vsI6）。兩個(gè)軟件均預(yù)測到共同DE-3′-UTR基因數(shù)分別為168、230和35個(gè)。

與Dapars相比，APAtrap在識(shí)別功能重要的APA事件和不同條件下動(dòng)態(tài)APA使用方面，功能更為強(qiáng)大，準(zhǔn)確性更高[16]。進(jìn)一步分析APAtrap的3 146個(gè)DE-3′-UTR基因長短轉(zhuǎn)錄本使用情況，發(fā)現(xiàn)前脂肪細(xì)胞分化后第2天，3′-UTR顯著變長；第4天與第2天相比，依然存在3′-UTR變長現(xiàn)象；然而，第6天與第4天相比，3′-UTR長度變短。此外，3′-UTR變短與3′-UTR變長的基因數(shù)比值隨前脂肪細(xì)胞分化不斷升高（見圖1A）。由此可見，京海黃雞前脂肪細(xì)胞在分化前期（I0-I4）傾向于使用3′-UTR更長的轉(zhuǎn)錄本，分化后期傾向于使用3′-UTR更短的轉(zhuǎn)錄本，分化過程傾向于使用3′-UTR更短的轉(zhuǎn)錄本。比較I2vsI4、I4vsI6的DE-3′-UTR基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)使用短3′-UTR基因表達(dá)水平更高（見圖1B），可能是短3′-UTR逃避microRNA結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)水平更高。

2.2.2 北京鴨

北京鴨皮下前脂肪細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)分析，得到DE-3′-UTR基因數(shù)為：Dapars，37、161、16、40和42個(gè)基因（T-48vsT0、T0vsT12、T12vsT24、T24vsT48、T48vsT72）；APAtrap，10、426、0、0和0個(gè)基因（T-48vsT0、T0vsT12、T12vsT24、T24vsT48、T48vsT72）；共同基因數(shù)分別為0和17個(gè)。

由于APAtrap在T12vsT24、T24vsT48、T48vsT72各組比較中均未預(yù)測到DE-3′-UTR基因，因此增加T0vsT24、T0vsT48、T0vsT72組比較，分別得到564、402和478個(gè)DE-3′-UTR基因。分析APAtrap得到的1 880個(gè)DE-3′-UTR基因長短轉(zhuǎn)錄本使用情況，發(fā)現(xiàn)在增殖和分化過程中均傾向于使用更短的轉(zhuǎn)錄本，且在前脂肪細(xì)胞分化24 h后，3′-UTR變短的基因數(shù)最多（見圖1C）。由此可見，北京鴨前脂肪細(xì)胞分化也傾向于使用更短的轉(zhuǎn)錄本。比較DE-3′-UTR基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在T-48vsT0、T0vsT12和T0vsT72差異基因中，使用短3′-UTR的基因表達(dá)水平更高（見圖1D）。

2.2.3 長白豬

長白豬皮下前脂肪細(xì)胞RNA-seq測序數(shù)據(jù)分析，Dapars和APAtrap兩個(gè)軟件均未預(yù)測到有3′-UTR差異基因。

2.2.4 小鼠3T3-L1

在3T3-L1細(xì)胞測序數(shù)據(jù)中，由Dapars分析得到的DE-3′-UTR基因數(shù)為7、25和32個(gè)基因（EPvsC、CvsT10 h、T10 hvsT6 d）；由APAtrap分析得到的DE-3′-UTR基因數(shù)為124、46和125個(gè)基因（EPvsC、CvsT10 h、T10 hvsT6 d）；在各組比較中，兩個(gè)軟件均預(yù)測到DE-3′-UTR基因數(shù)分別為3、9和18個(gè)。

分析APAtrap得到的295個(gè)DE-3′-UTR基因長短轉(zhuǎn)錄本使用情況，發(fā)現(xiàn)3T3-L1細(xì)胞在增殖階段，基因3′-UTR顯著變長；但是誘導(dǎo)分化10 h后，基因3′-UTR變短；分化的第6天與10 h相比，基因3′-UTR長度進(jìn)一步顯著變短（見圖1E）。由此得出結(jié)論，3T3-L1細(xì)胞分化過程傾向于使用更短的轉(zhuǎn)錄本。比較DE-3′-UTR基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Cvs10h組，使用長3′-UTR的基因表達(dá)水平更高，而10hvs6d組，使用短3′-UTR的基因表達(dá)水平更高（見圖1F）。

圖1 京海黃雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化過程中3′-UTR長度動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changesof 3′-UTR length during intramuscular preadipocytedifferentiation in Jinghai Yellow chicken

2.3 差異基因功能富集分析

2.3.1 京海黃雞

對(duì)3 146個(gè)DE-3′-UTR基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析（個(gè)別富集到的條目很少甚至沒有，因此未繪制直觀圖，見圖2）。其中，GO生物過程分析發(fā)現(xiàn)：I0vsI2顯著富集于蛋白質(zhì)定位調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝與合成和細(xì)胞自噬等；I2vsI4主要集中在核苷酸代謝和生物合成、蛋白磷酸化脫磷酸化和轉(zhuǎn)化生長因子受體信號(hào)通路；I4vsI6主要集中在基因表達(dá)、核苷磷酸生物合成與代謝。此外，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)：I2vsI4主要富集在磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和FoxO信號(hào)通路。

圖2 京海黃雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞不同分化時(shí)期DE-3′-UTR基因功能富集和通路分析Fig.2 Functional enrichment and pathway analysis of DE-3′-UTR genes at different differentiation stages of intramuscular preadipocytes in Jinghai Yellow chicken

GO功能富集和通路分析DE-exp基因發(fā)現(xiàn)，與DE-3′-UTR基因顯著富集到的生物過程和通路存在顯著不同。GO生物過程：I0vsI2組主要集中在脂質(zhì)代謝、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架組織等；I2vsI4組，除細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架組織外，還有細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)改性過程和細(xì)胞因子產(chǎn)生等；I4vsI6組，除脂質(zhì)代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞凋亡信號(hào)外，還有MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)控、蛋白激酶B信號(hào)和脂肪細(xì)胞分化調(diào)控等。KEGG通路分析：顯著富集的主要通路是細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和細(xì)胞老化。

根據(jù)GO和KEGG分析結(jié)果和已有文獻(xiàn)報(bào)道，篩選得到部分DE-3′-UTR基因作為靶基因用于進(jìn)一步研究（見表1）。

2.3.2 北京鴨

對(duì)北京鴨1 880個(gè)DE-3′-UTR基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析（見圖3）。GO富集（P＜0.05）得到BP和MF條目較少，展示排名最前的5個(gè)；KEGG通路富集分析（P＜0.05）得到的個(gè)別條目很少甚至沒有，不繪制直觀圖。GO分析：T-48vsT0，主要是核苷酸結(jié)合等分子功能；T0vsT12和T0vsT72，主要集中在系統(tǒng)發(fā)育和大分子生物合成過程；KEGG通路分析：T0vsT12，主要集中在TGF-beta信號(hào)通路、焦點(diǎn)粘連、甘油磷脂新陳代謝和MAPK信號(hào)通路；T0vsT72，主要集中在TGF-beta信號(hào)通路和磷酸肌醇代謝。

圖3 北京鴨皮下前脂肪細(xì)胞不同分化時(shí)期DE-3′-UTR基因功能富集和通路分析Fig.3 Functional enrichment and pathway analysisonDE-3′-UTR genes at different differentiation stages of subcutaneouspreadipocytedifferentiation in Pekin duck

DE-exp基因GO功能富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，T-48vsT0組，主要集中在信號(hào)傳導(dǎo)和生物調(diào)節(jié)生物過程；T0vsT12組，主要有核糖體、Wnt信號(hào)通路、TGF-beta信號(hào)通路和細(xì)胞周期等信號(hào)通路；T0vsT72組，有焦點(diǎn)粘連、細(xì)胞周期和脂肪酸代謝等信號(hào)通路。與DE-3′-UTR基因顯著富集到的通路相比，僅存在TGF-beta信號(hào)通路和焦點(diǎn)粘連兩條相同通路。由GO和KEGG分析結(jié)果，篩選得到部分DE-3′-UTR基因作為靶基因（見表1）。

表1 靶基因及其功能Table1 Target genesand their functions

2.3.3 3T3-L1細(xì)胞

小鼠3T3-L1細(xì)胞分化相關(guān)的295個(gè)DE-3′-UTR基因（見圖4），GO功能富集分析后發(fā)現(xiàn)顯著富集的生物過程包括：EPvsC，MAPK活性負(fù)調(diào)控、葡萄糖運(yùn)輸?shù)?；Cvs10h，主要集中在葡萄糖代謝過程正調(diào)控和細(xì)胞脂質(zhì)代謝等生物過程；10hvs6d，主要集中在蛋白質(zhì)定位、線粒體自噬和細(xì)胞周期等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)：EPvsC，主要集中在mTOR、EGFR酪氨酸激酶抑制劑和Ras信號(hào)通路。

圖4 3T3-L1細(xì)胞不同分化時(shí)期DE-3′-UTR基因功能富集和通路分析Fig.4 Functional enrichment and pathway analysisonDE-3′-UTR genesat different differentiation stagesof 3T3-L1 cells

DE-exp基因GO功能富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)：EPvsC組，主要集中在甘油脂代謝、細(xì)胞黏附和細(xì)胞周期等生物過程，以及蛋白質(zhì)消化吸收通路。Cvs10h組，有脂質(zhì)定位、蛋白定位調(diào)節(jié)、神經(jīng)元投射發(fā)育和mRNA加工等生物過程；10hvs6d組，除脂質(zhì)代謝、細(xì)胞周期、神經(jīng)元投射發(fā)育和mRNA加工等生物過程，及細(xì)胞自噬和Wnt信號(hào)通路等。由此可見，DE-exp基因與DE-3′-UTR基因富集到顯著不同的生物過程和信號(hào)通路。根據(jù)GO和KEGG分析結(jié)果，篩選得到部分DE-3′-UTR基因作為靶基因用于進(jìn)一步研究（見表1）。

2.4 microRNA調(diào)控

通過TargetScan和miRbase數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)個(gè)DE-3′-UTR基因microRNA結(jié)合位點(diǎn)（具有較多microRNA結(jié)合位點(diǎn)基因，僅展示5個(gè)，見表2），分析后發(fā)現(xiàn)gga-miR-216b可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程[18]；miR-15a通過與靶基因結(jié)合降低脂肪酸氧化，間接促進(jìn)雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化[19]；miR-128-3p過表達(dá)通過調(diào)控GREM1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞周期和凋亡，且LncRNA PVT1可通過miR-128-3p/GREM1軸調(diào)控BMP信號(hào)通路[20]。

表2 基因及靶向于該基因microRNATable 2 Genesand microRNAs targeting that genes

3 討論

不同組織類型中APA亞型相對(duì)豐度存在較大差異。例如血液和睪丸傾向于表達(dá)短3′-UTR亞型，而腦組織則呈相反趨勢[21]。一般情況下，增殖細(xì)胞和癌細(xì)胞中3′-UTR縮短，而在極化細(xì)胞和分化細(xì)胞中3′-UTR延長[22]。此外，不同細(xì)胞中poly（A）位點(diǎn)選擇也存在差異。Cheng等報(bào)道合胞滋養(yǎng)細(xì)胞（SCT）和B細(xì)胞分化過程中存在廣泛的3′-UTR縮短[23]。本研究發(fā)現(xiàn)前脂肪細(xì)胞來源不同，其分化過程中3′-UTR長度變化趨勢也存在差異，造成差異的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

分析3′-UTR長度與基因本身表達(dá)水平關(guān)系發(fā)現(xiàn)，兩者無顯著相關(guān)性，因而3′-UTR縮短或延長引起microRNA結(jié)合位點(diǎn)缺失或增加，對(duì)基因表達(dá)量可能無影響。通過TargetScan和miRbase對(duì)部分DE-3′-UTR基因分析，發(fā)現(xiàn)較多microRNA靶向于該基因mRNA 3′-UTR區(qū)域。microRNA可通過與其靶基因mRNA 3′-UTR結(jié)合而影響細(xì)胞分化，且許多microRNA可直接靶作用于脂肪形成相關(guān)基因參與動(dòng)物脂肪細(xì)胞增殖和分化調(diào)控，如miR-155可直接靶作用于脂肪形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ[24]，miR-215-5p可通過靶作用于NCOA3而負(fù)調(diào)控雞腹部脂肪形成[25]。此外，生物體內(nèi)一個(gè)microRNA調(diào)控許多靶基因，且microRNA與基因mRNA靶向互作關(guān)系因組織、細(xì)胞類型和生理狀態(tài)而不同[26]。因此，在前脂肪細(xì)胞分化過程中，microRNA與靶基因之間可能存在一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，下一步將重點(diǎn)研究脂肪形成相關(guān)靶基因鑒定和互作調(diào)控機(jī)制。

為探索前脂肪細(xì)胞不同分化階段相似性和差異性，比較各組DEGs表達(dá)（京海黃雞：I0vsI2、I2vsI4、I4vsI6；北京鴨：T-48vsT0、T0vsT12、T0vsT72；3T3_L1：EPvsC、Cvs10h、10hvs6d）的GO和KEGG分析結(jié)果。在京海黃雞各組比較中發(fā)現(xiàn)核苷磷酸生物合成和代謝過程是I2vsI4和I4vsI6組共同的生物過程，而在I0vsI2和I4vsI6組、I0vsI2和I2vsI4組中未發(fā)現(xiàn)共同生物過程。表明DE-3′-UTR基因表達(dá)在分化早期（I0和I2）變化明顯大于分化后期（I4和I6）。在北京鴨各組比較中發(fā)現(xiàn)核酸結(jié)合在T-48vsT0、T0vsT12和T0vsT72比較中存在，在T0vsT12和T0vsT72比較中有2個(gè)共同生物過程和2個(gè)共同分子功能。表明DE-3′-UTR基因表達(dá)在分化早期（T2）與分化后期（T72）差異不明顯。在3T3-L1細(xì)胞各組比較中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期和與脂肪相關(guān)的生物過程，表明DE-3′-UTR基因在分化早期與分化后期表達(dá)具有相似性，且在分化過程中DE-3′-UTR基因表達(dá)對(duì)脂肪合成與代謝起重要調(diào)控作用。Zhang等研究與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的功能和通路發(fā)現(xiàn)，包括磷酸肌醇代謝、FoxO信號(hào)通路、TGF-beta信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、焦點(diǎn)粘連、甘油磷脂新陳代謝、MAPK信號(hào)通路、脂質(zhì)代謝和mTOR信號(hào)通路等[27]。GO和KEGG分析DE-3′-UTR基因發(fā)現(xiàn)許多功能和通路相關(guān)研究較多。例如京海黃雞中甘油脂代謝過程、脂肪酸生物合成過程、磷酸肌醇代謝和FoxO信號(hào)通路；北京鴨中TGF-beta信號(hào)通路、焦點(diǎn)粘連、甘油磷脂新陳代謝和MAPK信號(hào)通路；3T3-L1細(xì)胞中MAPK活性調(diào)控、葡萄糖代謝過程、脂質(zhì)代謝和mTOR信號(hào)通路。因此，這些功能和信號(hào)通路可能是進(jìn)一步研究脂肪分化分子機(jī)制關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本研究中不同物種前脂肪細(xì)胞分化過程中3′-UTR長度存在動(dòng)態(tài)變化，3′-UTR長度變化趨勢存在物種差異。此外，3′-UTR長度存在動(dòng)態(tài)變化的基因，其功能同脂肪生成和脂類物質(zhì)代謝密切相關(guān)。本研究為進(jìn)一步探討脂肪生成分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對(duì)畜禽脂肪沉積選育提高有一定借鑒作用。