有機(jī)種植對玉米根際土壤代謝物的影響

王 玲，龍飛宇，劉佳斌，劉賀鳴，王宏燕*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國石油大學(xué)（北京）克拉瑪依校區(qū)工學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000）

有機(jī)種植系統(tǒng)禁止使用合成肥料和農(nóng)藥等人工材料，采用生態(tài)友好管理措施，以改善土壤健康狀況，通常被認(rèn)為較常規(guī)種植系統(tǒng)更可持續(xù)[1]。土壤細(xì)菌群落多樣性通常被認(rèn)為是反映生態(tài)系統(tǒng)土壤質(zhì)量狀況的生物指標(biāo)，有機(jī)種植為當(dāng)前土壤微生物群落問題提供有益解決方案。Lenc等試驗結(jié)果顯示，有機(jī)種植降低土壤源性植物病害[1]。Li等研究結(jié)果顯示，有機(jī)種植方式提高土壤病害抑制能力[2]。Hartmann等研究結(jié)果表明，有機(jī)肥施用引起土壤微生物群落變化，促進(jìn)土壤健康[3]。

根際土壤是植物生長最關(guān)鍵區(qū)域，是養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和土壤微生物群落研究熱點。Lareen等試驗結(jié)果表明，10%凈光合作用固定碳可作為根系分泌物釋放至根際，形成根際中不同微生物群落[4]。Swenson等研究結(jié)果表明，根際土壤微生物對有機(jī)化合物的新陳代謝也影響土壤微生物群落[5]。Mohanram和Kumar研究表明，根與微生物之間相互作用對植物生長非常重要[6]?？赏ㄟ^高通量測序與代謝組學(xué)方法了解根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤代謝產(chǎn)物，闡明其相互作用。

土壤代謝組學(xué)作為一項新興技術(shù)，可直接檢測土壤微生物對不同條件的生物反應(yīng)。Miller等試驗結(jié)果顯示，土壤代謝譜差異受作物種類、植物基因型和生長基質(zhì)等多方面影響[7]。Johns等研究表明，土壤代謝組學(xué)將土壤中有機(jī)/無機(jī)化合物和微生物群落結(jié)合，土壤代謝物可用作土壤污染生物標(biāo)志物[8]。因此，利用土壤代謝組學(xué)方法區(qū)分有機(jī)種植和常規(guī)種植的微生物群落功能可行，闡明根際代謝產(chǎn)物將有助于了解微生物群生化特征和不同種植方式下根際過程。

現(xiàn)階段有機(jī)種植條件下，根際土壤代謝物研究較少，且根際土壤中代謝組學(xué)與細(xì)菌群落缺乏聯(lián)合研究。本研究選擇黑龍江典型鹽堿黑土區(qū)作為采樣點，開展高通量測序和土壤代謝組學(xué)研究，旨在了解根際代謝物與土壤健康之間關(guān)系，揭示不同種植條件下玉米根際土壤代謝產(chǎn)物之間差異，通過差異代謝產(chǎn)物參與代謝通路，研究其參與的生物學(xué)過程，分析不同種植條件下根際土壤群落功能機(jī)制，通過根際化學(xué)與細(xì)菌群落相關(guān)性分析，以闡明有機(jī)種植條件下玉米根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)功能與土壤代謝物關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗地點位于黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)喇嘛甸鎮(zhèn)試驗園區(qū)，地理位置為46°42′N，124°46′E，屬于北溫帶亞歐大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫為3.8℃，年降水量為457.0 mm，土壤類型為蘇打鹽漬土。

試驗選取兩種類型樣地，分別為常規(guī)種植模式農(nóng)田樣地（CONV）和2004年后標(biāo)準(zhǔn)化有機(jī)種植模式農(nóng)田樣地（ORGN），常規(guī)種植在廣泛調(diào)查基礎(chǔ)上，根據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民平均施肥量和施肥施藥方式，使用傳統(tǒng)農(nóng)藥和除草劑，有機(jī)種植樣地不使用任何農(nóng)藥和除草劑等化學(xué)物質(zhì)，嚴(yán)格執(zhí)行有機(jī)產(chǎn)品生產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。種植玉米品種均為先玉335，播種和收獲時間相同，有機(jī)樣地采用多菌株組合微生物核心技術(shù)生產(chǎn)的生物有機(jī)肥，有機(jī)質(zhì)≥40%，總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）≥4%。有機(jī)種植與常規(guī)種植農(nóng)田等氮處理，其中有機(jī)種植施用有機(jī)肥（含氮量1.5%）7 260 kg·hm-2，玉米秸稈還田量4 500 kg·hm-2（含氮量0.58%），常規(guī)種植施用復(fù)合肥（N-P-K=14%-16%-15%）643.5 kg·hm-2和尿素（N=46%）96.75 kg·hm-2。

1.2 土壤采集和理化性質(zhì)測定

2020年7月于玉米抽雄期分別在有機(jī)種植和常規(guī)種植農(nóng)田取樣，每次重復(fù)選取5棵玉米植株，隨機(jī)挖取3個剖面并收集10~15cm土層玉米根，輕輕搖動根部后取樣，所有根際土壤均是從距根表面不到5 mm地方采集，共6次重復(fù)。所有取樣土壤置于冷藏箱運(yùn)回實驗室，提取DNA前，保存在-80℃。土壤理化性質(zhì)參照鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》測定[9]。土壤堿化度=鈉離子交換量/陽離子交換量。土壤含鹽量測定，1∶5土水比混合，振蕩5 min后過濾得到上層清液，烘干法測定總土壤含鹽量質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 高通量測序

采用Z.N.A.土壤DNA試劑盒（美國歐米茄）提取土壤DNA，NanoDrop（Thermo Science）測量，并通過瓊脂糖凝膠電泳作評估。針對16SrRNA V4-V5區(qū)特異性引物F515（5′GTGCCA GCM GCCGCG 3′）和R907（5′CCGTCA ATTCMTTTRAGTTT3′）對細(xì)菌16SrRNA作擴(kuò)增，每個樣品引物序列中均包含6 bp特異性標(biāo)簽序列用于區(qū)分不同樣品。PCR反應(yīng)程序為：95℃3 min，35個循環(huán)：95℃30 s：55℃30 s：72℃45 s，72℃10 min。每個樣品3個重復(fù)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠電泳（80 V，20 min）鑒定和分離條帶，使用凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit，TaKaRa）對PCR產(chǎn)物純化，QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)（Promega，Madison，USA）檢測定量，使用Illumina Miseq平臺測序。

1.4 土壤代謝物測定

將1 g土樣放入5 mL Eppendorf（EP）管中，加入1 mL甲醇∶水=3∶1（V/V）和1 mL乙酸乙酯，以10μL阿多酚（0.5 mg·mL-1）為內(nèi)標(biāo)。樣品在45 Hz球磨機(jī)中勻漿4 min，后在冰水中超聲5 min，隨后樣品在12 000 r·min-1和4℃下離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到5 mL EP管中。再次加入1 mL甲醇∶H2O=3∶1（V/V）和1 mL乙酸乙酯。重復(fù)研磨和離心步驟，將上清液合并在真空濃縮器中干燥，不加熱。用30μL鹽酸甲氧胺（20 mg·mL-1）溶解樣品，80℃孵育30 min。

代謝物用氣相色譜儀（Agilent7890，圣克拉拉，加利福尼亞州）和Pegasus HT質(zhì)譜儀（GCTOF-MS，Leco，圣約瑟夫，密西西比州）檢測。為消除和減少試驗和分析過程中誤差，對代謝組數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理，去除缺失值大于20%特征值，缺失值填充方法采用極小值填充，為減少系統(tǒng)誤差，提高樣品之間可比性對數(shù)據(jù)作歸一化處理。

1.5 統(tǒng)計分析

指數(shù)分析采用mothur（version v.1.30.2），用于指數(shù)評估的OTU相似水平97%（0.97）；RDA分析采用R語言vegan包中RDA分析和作圖；兩組比較分析采用R（version 3.3.1）的stats包和python的scipy包；主成分分析（PCA）采用ropls（Rpackages）；VIP分析采用ropls（R）和scipy（Python）；差異代謝物分析采用ropls（R packages），聚類分析和KEGG通路分析采用scipy（Python），對代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)作log化處理，使其符合正態(tài)分布，利用Student′st檢驗數(shù)據(jù)差異；相關(guān)性分析采用scipy（Python）Version1.0.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由表1可知，種植方式導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)不同，有機(jī)種植處理中鹽堿地土壤pH、堿化度和總鹽量顯著低于常規(guī)種植處理，土壤中全氮（TN）、有機(jī)質(zhì)（OM）和速效鉀（AK）顯著升高，與其他研究結(jié)果一致。李思萌等研究有機(jī)種植對鹽堿地理化性質(zhì)的影響結(jié)果表明，有機(jī)處理提高全氮、全磷（TP）和速效鉀含量[10]。有機(jī)處理中pH降低，主要原因在于有機(jī)種植通過秸稈還田和施用有機(jī)肥，改善土壤孔隙度和土壤粒級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)鹽分下降。有機(jī)種植處理的速效氮（AN）含量顯著低于常規(guī)種植，與常規(guī)處理施用化肥，速效養(yǎng)分含量較高有關(guān)。總體看，有機(jī)種植處理提高土壤中全量養(yǎng)分含量，則與有機(jī)種植施用有機(jī)肥有關(guān)。

表1 有機(jī)種植與常規(guī)種植土壤理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of the organic and conventional soil

2.2 土壤代謝物

2.2.1 土壤代謝物代謝圖譜分析

采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)方法，分別以正離子模式和負(fù)離子模式測定土壤中4 458種和3 187種代謝物。根據(jù)人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）和京都基因和基因組百科全書（KEGG），共鑒定并命名483種代謝物。脂類及類脂分子181種、有機(jī)雜環(huán)化合物52種、有機(jī)酸及衍生物45種、有機(jī)氧化合物37種、苯丙素和聚酮類化合物29種、苯環(huán)型化合物21種、核苷、核苷酸和類似物7種、含氮有機(jī)化合物6種、生物堿及衍生物3種、烴類化合物3種、有機(jī)硫化合物2種、其他類化合物97種。在這些化合物中，脂類及類脂分子數(shù)量最多，占代謝物總數(shù)37.47%，其次是有機(jī)雜環(huán)化合物（10.77%）、有機(jī)酸及其衍生物（9.32%）和有機(jī)氧化物（7.66%）。所檢測得到化合物，即土壤代謝物，來自植物根系分泌物、微生物代謝物和微生物，以及植物、微生物和土壤有機(jī)質(zhì)分解。然而，區(qū)分代謝物來自微生物或植物仍是根際代謝組學(xué)面臨的最大挑戰(zhàn)。

2.2.2 主成分分析

采用多變量數(shù)據(jù)分析方法，研究種植方式對土壤代謝物的整體影響，以區(qū)分有機(jī)種植和常規(guī)種植方式下代謝變化，使用統(tǒng)計學(xué)上主成分分析法（PCA）作分析，PCA從總體上反應(yīng)樣本間差異及代謝物表達(dá)模式差異大小。使用ropls（Rpackages）軟件（Version1.6.2）作分析，得到一組擬合兩個主成分PCA模型，陽離子累計R2X=0.568，陰離子累計R2X=0.543，模型參數(shù)數(shù)值均大于0.5，且二者數(shù)值均在置信區(qū)間，說明根據(jù)試驗建立PCA模型穩(wěn)定，可用于代謝組學(xué)試驗及代謝差異分析。圖1主成分分析結(jié)果表明，有機(jī)種植處理中代謝產(chǎn)物與常規(guī)處理明顯不同，沿第一坐標(biāo)軸表現(xiàn)明顯分離。

圖1 差異代謝產(chǎn)物陰陽離子主成分分析Fig.1 Principal component analysisof positiveand negativeof differential metabolites

2.2.3 土壤差異代謝物確定

通過差異火山圖（見圖2）可知，土壤中檢測到176種代謝物在有機(jī)土壤和常規(guī)土壤中含量存在顯著差異（P＜0.05，VIP＞1）。其中有機(jī)土壤中，36種代謝產(chǎn)物表達(dá)量上升，包含生物堿及衍生物1種、核苷、核苷酸和類似物1種、有機(jī)氧化合物2種、苯丙烷和聚酮化合物2種、有機(jī)酸及衍生物3種、有機(jī)雜環(huán)化合物7種、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子9種，其他類11種；140種代謝產(chǎn)物表達(dá)量下降，包含碳?xì)浠衔?種、有機(jī)氮化合物2種、核苷、核苷酸和類似物3種、苯類代謝物4種、有機(jī)氧化合物8種、苯丙烷和聚酮代謝物9種、有機(jī)酸及衍生物11種、有機(jī)雜環(huán)化合物16種、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子45種，其他類40種。結(jié)果表明，脂類代謝產(chǎn)物在有機(jī)和常規(guī)處理中比例最高，其中生物堿及衍生物代謝物僅在有機(jī)種植處理中上升，研究表明其對病原菌具有拮抗作用，可提高植物抗逆性，促進(jìn)植物生長[2]。

圖2 根際土壤差異代謝產(chǎn)物火山圖Fig.2 Volcanic map of differential metabolitesin soil rhizosphere

苯類、碳?xì)漕惡陀袡C(jī)氮化合物代謝產(chǎn)物僅在常規(guī)處理中上升，苯類代謝產(chǎn)物在常規(guī)處理中增多可能與常規(guī)處理中殺蟲劑、殺菌劑某些成分或農(nóng)藥中的苯類化合物有關(guān)。碳?xì)浜陀袡C(jī)氮化合物在常規(guī)處理中含量顯著上升可能與施用氮肥有關(guān)，Chen等研究表明，氮肥施入土壤可激發(fā)土壤氮素礦化、吸收，并極易被微生物吸收利用[11]。

為進(jìn)一步說明土壤代謝物詳細(xì)變化，本研究計算OPLS-DA模型中VIP值。VIP值＞1.0和P值＜0.05代謝物被認(rèn)為是受不同種植處理顯著影響的代謝物（t檢驗）。VIP值最高的前30種代謝物列在圖3中。所有VIP值高的代謝物在根際土壤中均有顯著變化，有機(jī)處理中奧洛他定氮氧化物（Olopatadine n-oxide）、11-羥基吐溫（11-Hydroxytubotaiwine）、（+）Galeon（苯丙烷和聚酮化合物）、Retrofractamide D（有機(jī)雜環(huán)化合物）、5-甲氧基色氨酸（5-Methoxytryptophan）代謝物相對含量與常規(guī)處理相比顯著上升，且差異倍數(shù)達(dá)到2倍以上。而DEGUELIN（-）、替曲那新（Tetronasin）、異丙醇四氫呋喃（Ipomeatetrahydrofuran）、N-（1-脫氧-1-果糖基）苯丙氨酸（N-（1-Deoxy-1-fructosyl）phenylalanine）、6-苯基-3-己烯-2-酮（6-Phenyl-3-hexen-2-one）、5，7-二羥基-3-甲氧基黃酮（5,7-Dihydroxy-3-methoxyflavone）、17-羥基孕酮（17-Hydroxyprogesterone）、15-脫氧-β-12，14-前列腺素J2（15-Deoxydelta-12,14-PGJ2）、（E,Z）-2,4-十二碳二烯（（E,Z）-2,4-Dodecadiene）、（E）-5-（3,4,5,6-Tetrahydro-3-pyridylidenemethyl）-2-furanmethanol（氫吡啶類化合物）、5-甲氧基色酚（5-Methoxytryptophol）含量較常規(guī)處理顯著下降，差異倍數(shù)同樣達(dá)到2倍以上。有機(jī)種植處理中根際土壤代謝物增加最多的是奧洛他定氮氧化物，下降最多的是17-羥基孕酮。奧洛他定氮氧化物屬于有機(jī)酸及其衍生物，Shi等研究發(fā)現(xiàn)，作為主要根系分泌物的有機(jī)酸是根際土壤微生物群落變化主要驅(qū)動因素[12]，說明有機(jī)處理刺激玉米有機(jī)酸分泌。本試驗還發(fā)現(xiàn)有機(jī)處理中部分氨基酸代謝產(chǎn)物含量降低，與前人研究一致，Ding等研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥施用顯著降低部分氨基酸及其前體含量，說明有機(jī)肥施用明顯抑制土壤中氨基酸合成和代謝[13]。

圖3 根際土壤差異代謝產(chǎn)物VIP分析Fig.3 VIPanalysis of differential metabolites in soil rhizosphere

2.2.4 土壤代謝物代謝途徑

通過途徑富集分析闡明土壤代謝過程具體變化。如圖4所示，嘧啶代謝（Pyrimidinemetabolism）、色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）、類固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）、星形孢菌素生物合成（Staurosporine biosynthesis）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、吲哚生物堿生物合成（Indole alkaloid biosynthesis）是差異代謝產(chǎn)物之間最重要代謝通路，這些通路主要參與氮代謝和碳代謝途徑，其中嘧啶代謝、硫代葡萄糖苷生物合成、類固醇激素生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、星形孢菌素生物合成達(dá)到顯著差異，嘧啶代謝途徑中胸苷（Thymidine）、脫氧胞啶（Deoxycytidine）在有機(jī)處理中含量顯著下降，尿嘧啶（Uracil）含量顯著上升，類固醇激素生物合成途徑中3種差異代謝物雄性激素（Testosterone）、17-羥基孕酮和四氫皮質(zhì)酮（Tetrahydrocortisone）在有機(jī)處理中顯著下降，星形孢菌素生物合成通路中主要有兩種代謝產(chǎn)物L(fēng)-脯氨酸（L-Proline）和L-色氨酸（L-Tryptophan），同時參與礦物質(zhì)吸收，在有機(jī)處理中顯著下降，苯丙烷生物合成途徑中4-羥基-3-甲氧基肉桂醛（4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde）同樣參與次生代謝產(chǎn)物合成途徑，在有機(jī)處理中上升，而L-苯丙氨酸參與礦物質(zhì)吸收、生物代謝等多種途徑在有機(jī)處理中顯著下降。

圖4 土壤代謝物代謝途徑富集Fig.4 Enrichment of metabolic pathway of soil metabolites

2.3 土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)

土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性見表2。有機(jī)處理土壤Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)均高于常規(guī)處理，且差異顯著（P＜0.05）。有機(jī)系統(tǒng)中微生物多樣性增加與所應(yīng)用管理密切相關(guān)，包括采用減少或不存在化學(xué)品投入和生物植物保護(hù)等相關(guān)有機(jī)修復(fù)和實踐措施。常規(guī)種植方式中微生物多樣性減少可通過使用殺蟲劑、殺真菌劑和除草劑等引起的直接或間接長期脅迫解釋，這些農(nóng)用化學(xué)品減少總微生物多樣性，可能抑制或消除某些微生物群，造成適應(yīng)生長的微生物群落存活。國外研究同樣發(fā)現(xiàn)有機(jī)種植生物多樣性水平更高[14]。

表2 有機(jī)種植與常規(guī)種植土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table2 Diversity index of soil bacterial community in organic and conventional soil

通過db-RDA約束性對應(yīng)分析（Distance-based redundancy analysis），采用Bray-Curtis距離算法，將對應(yīng)分析與多元回歸分析結(jié)合，每一步計算均與環(huán)境因子進(jìn)行回歸，從而反映環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性關(guān)系。db-RDA分析結(jié)果表明（見圖5），pH、OM、TN、TP和TK是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化最重要土壤因子。與前人研究一致，Dean等研究表明土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化均與土壤特性相關(guān)[15]。Bell等研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)種植方式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響可能是由土壤pH和養(yǎng)分含量的直接影響造成[16]。另外，本研究中有機(jī)種植和常規(guī)種植土壤中細(xì)菌群落可沿第一坐標(biāo)軸分離，這與土壤代謝物結(jié)果一致。

圖5 土壤細(xì)菌群落db-RDA約束性對應(yīng)分析Fig.5 Distance-based redundancy analysisof soil bacterial community

基于各處理中群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用單因素方差分析（one-way ANOVA），對不同處理中細(xì)菌群落中表現(xiàn)出豐度差異的物種作組間差異顯著性檢驗，得到物種差異檢驗柱形圖（見圖6）。放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）在有機(jī)種植土壤中顯著高于常規(guī)種植，其相對豐度升高與土壤中未分解的有機(jī)物有關(guān)，放線菌門具有降解纖維素的能力，能夠分解有機(jī)種植中施入的大量有機(jī)物[17]，綠彎菌門可用于根際中古老或較老的土壤有機(jī)質(zhì)降解，綠彎菌門某些屬降解有機(jī)物質(zhì)，例如纖維素，半纖維素或幾丁質(zhì)。變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）在有機(jī)種植土壤中顯著低于常規(guī)種植，變形菌門具有降解難降解有機(jī)化合物的能力，常規(guī)種植含量升高可能與施入農(nóng)藥有關(guān)。酸桿菌門被報道適應(yīng)養(yǎng)分貧瘠的土壤，研究表明酸桿菌門相對豐度可作為土壤質(zhì)量健康的一個指標(biāo)[18]，土壤質(zhì)量越好酸桿菌門相對豐度越低，表明有機(jī)種植方式較常規(guī)種植方式更能保持土壤質(zhì)量。

圖6 土壤細(xì)菌群落組間差異顯著性檢驗Fig.6 Test of significance of differencebetween groupsof soil bacterial community

2.4 土壤差異代謝產(chǎn)物與細(xì)菌群落相關(guān)性

土壤中代謝產(chǎn)物與土壤微生物之間存在相互作用，研究細(xì)菌群落和代謝產(chǎn)物之間相關(guān)性具有重要意義。為進(jìn)一步闡明根際差異代謝物和微生物之間關(guān)系，基于細(xì)菌群落中有機(jī)種植與常規(guī)種植之間具有顯著差異的物種，依據(jù)細(xì)菌相對豐度和差異代謝產(chǎn)物峰面積評估Pearson相關(guān)性，構(gòu)建相關(guān)性熱圖關(guān)聯(lián)分析（見圖7）。結(jié)果顯示，土壤細(xì)菌群落中變形菌門、酸桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、蘇氏桿菌門（Sumerlaeota）、蛭弧菌門（Bdellovibrionota）、Abditibacteriota、纖維桿菌門（Fibrobacterota）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）與絕大多數(shù)差異代謝物之間呈正相關(guān)，而放線菌門、綠彎菌門、Patescibacteria、Latescibacterota、鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、Deinococcota與絕大多數(shù)差異代謝物呈負(fù)相關(guān)。差異代謝產(chǎn)物中考馬林酸甲醚（Coumarinic acid methyl ether）、加諾德里奧爾I（Ganoderiol I）、維拉寧A（Vialinin A）、4-羥基-3-甲氧基肉桂醛、（E）-2，6-二甲基-2，5-庚二烯酸、亞甲胺對土壤細(xì)菌群落的作用與其他差異代謝物呈相反趨勢。變形菌門與甲基三烯酮（Methyltrienolone）、Sylpin，3-[4-羥基-3-（3-甲基-2-烯-1-基）苯基]丙-2-烯酸（3-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-en-1-yl）phenyl]prop-2-enoic acid）呈極顯著正相關(guān)，放線菌門與6-脫氧葉黃素乙（6-deoxyerythronolide B）、前列腺素F3a（Prostaglandin F3a）、3-[4-羥基-3-（3-甲基-2-烯-1-基）苯基]丙-2-烯酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，綠彎菌門與甲基三烯酮、3-[4-羥基-3-（3-甲基-2-烯-1-基）苯基]丙-2-烯酸呈極顯著負(fù)相關(guān)。其他研究同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落和根際代謝產(chǎn)物之間相關(guān)性，Li等發(fā)現(xiàn)秸稈還田作用下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與糖、有機(jī)酸具有相關(guān)性[19]，賈甜華研究同樣發(fā)現(xiàn)植物根際微生物與根系分泌物之間具有相關(guān)性[20]。

圖7 土壤差異代謝物與細(xì)菌群落相關(guān)性熱圖Fig.7 Heatmap of the correlation between soil differential metabolitesand bacterial community

3 討論

有機(jī)和常規(guī)種植制度在施肥方式、種植強(qiáng)度、除草劑使用和作物種類或基因型方面存在差異。侯寧等研究表明，這些因素是導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)、根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化重要原因，且有機(jī)種植可轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)有益的微生物類群[21]。本研究表明與常規(guī)種植相比，有機(jī)種植在鹽堿土壤中降低土壤pH，提高土壤中全量養(yǎng)分含量和土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度。目前研究中，對于長期有機(jī)種植和常規(guī)種植下土壤微生物多樣性和組成的了解仍有限且存在爭議，有機(jī)種植與常規(guī)種植對比分析結(jié)果并不一致。部分研究表明，有機(jī)農(nóng)業(yè)中使用的糞便可能將含有某些病原菌群微生物引入土壤；與常規(guī)種植相比，有機(jī)種植微生物多樣性無顯著差異，甚至更低[22]。

目前關(guān)于有機(jī)和常規(guī)種植根際土壤代謝產(chǎn)物研究較少，通過土壤代謝產(chǎn)物結(jié)合組學(xué)信息技術(shù)分析，可極大提高不同種植方式對農(nóng)作物不同影響的理解。本研究利用LC-MC非靶向代謝組學(xué)檢測有機(jī)種植和常規(guī)種植處理土壤樣品，共檢測到正負(fù)離子7 645種代謝物，其中鑒定并命名483種代謝物，鑒定代謝物比例僅為6.3%，大量色譜峰未被鑒定，因此利用代謝物PCA和差異火山圖比較有機(jī)和常規(guī)處理組成和含量形成，結(jié)果表明玉米根際土壤代謝圖譜發(fā)生明顯分離，176種代謝產(chǎn)物在處理中差異顯著。

本研究顯示，差異代謝產(chǎn)物中脂質(zhì)及衍生物在根際土壤代謝中含量高，與陳靜等研究秸稈還田對溫室黃瓜根際土壤代謝結(jié)果一致，不同處理之間脂質(zhì)代謝產(chǎn)物在土壤代謝產(chǎn)物中比重最高[23]。但也有研究顯示不同結(jié)果，Song等研究辣椒根際土壤代謝物發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸數(shù)量最多，其次是碳水化合物、醇和氨基酸[24]；Liu等研究低氮對大豆根際土壤代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸含量最多，其次是糖醇、氨基酸等次生代謝產(chǎn)物[25]；Carvalhais等研究不同植物根系分泌物發(fā)現(xiàn)大部分由有機(jī)酸和糖構(gòu)成[26]。Hayden等利用LCMS代謝組學(xué)方法鑒別谷類作物抑病土壤發(fā)現(xiàn)，同抑制性土壤相比非抑制性土壤中脂質(zhì)和萜類含量更豐富，有機(jī)種植土壤因施用大量生物有機(jī)肥被認(rèn)為是抑制性土壤不利于病原菌生存[27]。本研究表現(xiàn)相似結(jié)果，在常規(guī)處理中脂質(zhì)和萜類相對含量更高，脂類由植物和微生物合成，是細(xì)胞代謝底物和產(chǎn)物，為植物和微生物代謝過程提供能量，并參與信號傳導(dǎo)，常規(guī)處理中含量較高，可能與化肥中營養(yǎng)元素利于吸收有關(guān)，使植物營養(yǎng)物質(zhì)積累。

有機(jī)酸在植物和微生物代謝中具有重要作用，是碳代謝循環(huán)中重要參與物，是驅(qū)動根際微生物群落變化重要因素。植物通過有機(jī)酸積累維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，提高植物對堿脅迫適應(yīng)能力，有機(jī)酸含量上升，有利于鹽堿土壤中玉米生長。但有機(jī)酸分泌同樣對植物具有化學(xué)自毒作用[28]，影響植物根系正常發(fā)育并對植物愈傷組織生長具有抑制作用，有機(jī)酸達(dá)到一定濃度促進(jìn)病原菌生長，導(dǎo)致植物病害發(fā)生。本研究中有機(jī)種植差異代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸種類和含量較常規(guī)種植更低，可為常規(guī)種植與有機(jī)種植相比病害更嚴(yán)重提供新依據(jù)，且有機(jī)酸含量和種類提高，對土壤pH影響更為顯著，也為長期施用化肥導(dǎo)致土壤pH降低提供依據(jù)，此前大量研究表明化肥施用導(dǎo)致土壤酸化原因是尿素經(jīng)氮素循環(huán)產(chǎn)生氫離子，導(dǎo)致土壤pH下降。

本研究結(jié)果顯示，差異代謝物中僅生物堿及衍生物在有機(jī)處理中上升，生物堿既參與多種生理過程，如細(xì)胞伸長、根冠信號傳導(dǎo)、水分平衡、氣孔運(yùn)動和光合作用，促進(jìn)植物生長，同時生物堿又是一種天然抗菌物質(zhì)，具備較大抗菌圖譜，通過抑制病原菌細(xì)胞壁合成，降低細(xì)菌代謝速率，抑制細(xì)胞生長和分裂相關(guān)蛋白生長，例如白屈菜紅堿可通過阻斷細(xì)胞膜物質(zhì)生產(chǎn)，抑制變形桿菌生長，并破壞其細(xì)胞膜完整性[29]，有機(jī)種植中生物堿含量上升，此為有機(jī)種植較常規(guī)種植病害發(fā)病率低的原因。

本試驗中代謝產(chǎn)物產(chǎn)生差異重要原因是不同種植方式影響植物根際和微生物代謝途徑（見圖4）。常規(guī)種植中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成增強(qiáng)，導(dǎo)致玉米植株中莽草酸代謝途徑增強(qiáng)，使植物體內(nèi)抗氧化劑合成含量增加[30]，從而表現(xiàn)出玉米植株在常規(guī)種植下因化肥農(nóng)藥脅迫適應(yīng)性特征。常規(guī)種植方式同樣刺激類固醇激素生物代謝途徑和星形孢菌素代謝途徑增強(qiáng)，推測在根際代謝中，這些代謝產(chǎn)物具有相似功能特征，既促進(jìn)植物根系生長又促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用。有機(jī)種植處理提高苯丙烷生物合成途徑中4-羥基-3-甲氧基肉桂醛含量，其參與次生代謝產(chǎn)物生成，或許是有機(jī)種植植株產(chǎn)生差異性狀的原因之一。硫代葡萄糖苷生物合成在有機(jī)種植中代謝強(qiáng)度較常規(guī)種植低，這可能與硫代葡萄糖苷作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物主要參與植物應(yīng)對脅迫環(huán)境有關(guān)[31]。在植物面對納米粒子、殺蟲劑、殺菌劑、抗生素、重金屬等脅迫時體內(nèi)硫代葡萄糖苷含量上升，有機(jī)種植方式對植物造成的環(huán)境脅迫強(qiáng)度低于常規(guī)種植中農(nóng)藥以及多發(fā)病害對植物的脅迫，導(dǎo)致其生物合成較低。

土壤微生物群落和功能變化可為土壤代謝組學(xué)分析提供證據(jù)，土壤性質(zhì)和細(xì)菌群落均可調(diào)節(jié)土壤代謝庫，為確定在有機(jī)種植制度下土壤細(xì)菌群落與根際土壤代謝物圖譜之間可能的聯(lián)系模式，開展Pearson相關(guān)分析。結(jié)果表明，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和根系分泌物之間具有相關(guān)性（見圖7），張志英等在大豆研究中也得出同樣結(jié)論，表明根系分泌物與根際微生物密切相關(guān)[32]。本研究中，放線菌門與6-脫氧葉黃素乙、前列腺素F3a、3-[4-羥基-3-（3-甲基-2-烯-1-基）苯基]丙-2-烯酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，綠彎菌門與甲基三烯酮、3-[4-羥基-3-（3-甲基-2-烯-1-基）苯基]丙-2-烯酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，且大多數(shù)差異代謝物與放線菌門和綠彎菌門呈顯著負(fù)相關(guān)，而有機(jī)種植土壤中，這些代謝物在根系分泌物中表達(dá)量呈下調(diào)趨勢，結(jié)合兩者說明有機(jī)種植可能有利于放線菌門和綠彎菌門聚集，最終導(dǎo)致其相對豐度顯著升高。db-RDA分析顯示放線菌門和綠彎菌門與土壤中全量氮磷鉀呈正相關(guān)（見圖5），因此推論有機(jī)種植可能通過提高土壤中營養(yǎng)成分，影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，影響根際土壤部分代謝產(chǎn)物。

4 結(jié)論

本研究通過土壤代謝組學(xué)和高通量測序，揭示有機(jī)種植和常規(guī)種植土壤中代謝產(chǎn)物組成、代謝途徑以及土壤細(xì)菌群落組成和功能差異。研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)種植土壤細(xì)菌群落多樣性高于常規(guī)種植，pH、OM、TN、TP和TK是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化最重要土壤因子，有機(jī)種植促進(jìn)有機(jī)酸及衍生物分泌和生物堿及衍生物代謝，降低一些氨基酸及其前體含量，而苯類、碳?xì)漕惡陀袡C(jī)氮化合物在常規(guī)種植中增加，差異代謝產(chǎn)物之間最重要代謝通路是氮和碳代謝途徑，其中通路中尿嘧啶含量在有機(jī)處理中顯著上升。根際土壤差異代謝物與土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，部分差異代謝物在根系分泌物中表達(dá)量下調(diào)導(dǎo)致有機(jī)種植根際土壤中放線菌門和綠彎菌門豐度升高。

綜上所述，有機(jī)種植模式為微生物創(chuàng)造良好生存環(huán)境，與常規(guī)種植相比改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，改變根際部分土壤代謝產(chǎn)物和代謝通路，對土壤生態(tài)環(huán)境具有積極意義。本研究結(jié)果為不同種植方式對根系相關(guān)微生物群落的維持機(jī)制提供新見解。值得注意是，雖然代謝組學(xué)分析特定條件下特定時間代謝物，但土壤代謝物動態(tài)變化及其與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系還需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。