引種栽培條件下大花黃牡丹根際微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)

高丹蕾，吳璐瑤，孟凡志，袁 濤*

（1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，園林環(huán)境教育部工程研究中心，北京 100083；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018）

植物生長發(fā)育高度依賴養(yǎng)分吸收，根際養(yǎng)分是限制因素之一。這種限制迫使陸地植物進(jìn)化出各種策略，包括與土壤根際微生物的有益相互作用、植物根和真菌之間共生相互作用等[1]。植物在生長過程中通過調(diào)節(jié)有機(jī)酸、氨基酸、酚類物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑等根系分泌物招募微生物，根際微生物種類和數(shù)量也影響植物生長發(fā)育[2]。根際細(xì)菌向宿主植物提供自身合成有益化合物，如節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）通過分泌細(xì)胞分裂素等植物生長激素促進(jìn)植物根系發(fā)育[3]；許多根際真菌抑制土壤傳播的植物病原體，其對病原體的控制機(jī)制包括養(yǎng)分競爭、分泌抗生素和誘導(dǎo)抗性等[4]；叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungus，AMF）滲透到植物根皮層細(xì)胞中并形成一種特殊的叢枝狀結(jié)構(gòu)，作為真菌和宿主植物之間代謝物的交換媒介，有利于植物吸收更多養(yǎng)分[5]，還可通過產(chǎn)生抗生素、誘導(dǎo)抗性和提供物理屏障等方式保護(hù)宿主植物免受病原體侵害[4]。

根際微生物促進(jìn)植物生長發(fā)育，對植物引種馴化具有重要意義。Chen等發(fā)現(xiàn)接種地表球囊霉（Glomusversiforme）和摩西球囊霉（G.mosseae）可提高南美蟛蜞菊（Sphagneticola trilobata）在進(jìn)入新生長環(huán)境后抗病能力[6]；Majewska等調(diào)查分布于中歐37種外來植物根部AMF種類及其土壤營養(yǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)其中35種（占94.59%）外來植物均與AMF形成緊密關(guān)系，且具有相當(dāng)豐度[7]。因此，探究植物生長根際微生物因素可為野生植物引種栽培提供新思路。

大花黃牡丹（Paeonia ludlowii）是芍藥科芍藥屬落葉灌木，我國特有種，主要分布于西藏林芝市巴宜區(qū)至米林縣海拔2 900~3 200 m雅魯藏布江河谷及林緣、坡麓狹長地帶[8]，是芍藥屬瀕危等級最高的物種之一[9]。目前，國內(nèi)西藏以外地區(qū)引種大花黃牡丹成功率較低，且關(guān)于大花黃牡丹引種栽培研究僅涉及引種至蘭州[10]、北京[11]和欒川[12-13]后栽培管理措施及成活情況，以及欒川引種地大花黃牡丹枝條發(fā)育特點(diǎn)和繁育系統(tǒng)[14-15]，并未涉及土壤理化性質(zhì)及根際微生物。

因微生物生長受限或培養(yǎng)基適應(yīng)性差異，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法獲得全面微生物種群信息。近年來分子生物學(xué)技術(shù)高速發(fā)展，高通量測序技術(shù)打破傳統(tǒng)方法局限性，幫助全面深入了解植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)并大量開發(fā)未知微生物資源，如曹敏等通過高通量測序分析不同產(chǎn)地茅蒼術(shù)（Atrac?tylodeslancea）根際AMF群落結(jié)構(gòu)的地理分布格局差異[16]。本文基于高通量測序技術(shù)，分析位于河南省欒川縣引種栽培多年大花黃牡丹不同土層深度根際細(xì)菌、根際真菌和叢枝菌根真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，為探尋大花黃牡丹引種后優(yōu)勢根際微生物類群提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究地概況與樣品采集

研究地位于河南省洛陽市欒川縣芍藥科遷地保護(hù)圃，海拔1 240 m，大陸性季風(fēng)氣候，平均年降水量800~1 000 mm，常年最高氣溫35℃，最低氣溫-10℃，年均相對濕度達(dá)66%[17]?，F(xiàn)有大花黃牡丹開花株600余株，系2002年秋播種育成，種子采自西藏林芝市巴宜區(qū)野生大花黃牡丹居群，2008年首次開花，開花株采收種子育苗后，仍正常開花結(jié)實(shí)[13]。自2015年起，每年僅夏季清除一次雜草，未施肥。圃內(nèi)大花黃牡丹根系主要分布于0~20 cm深土層（見圖1），肉質(zhì)根系粗壯，其上密生吸收根，近地表處吸收根分布密集。至2021年，圃內(nèi)大花黃牡丹最大株齡為18年，穩(wěn)定開花。

2020年8月，大花黃牡丹果實(shí)成熟期，根據(jù)引種圃內(nèi)地形、大花黃牡丹根系分布范圍（見圖1）及植株栽植密度設(shè)置5 m×25 m樣方并確定取樣深度（地下0~20 cm）。樣方中隨機(jī)選擇5株作為5次重復(fù)，每株基部25 cm處設(shè)置3個(gè)取樣點(diǎn)，去除表面枯落物，以地面為基準(zhǔn)，向下0~10 cm為上層，10~20 cm為下層，用土鉆分層取土，每層3個(gè)取樣點(diǎn)混合作為1份樣品，5次重復(fù)在上下兩層共取10份土樣。從每份土樣中取出根系并抖落附著其上的大塊土壤，輕輕刷下附著根系表面根際土。70%乙醇沖洗根系2次，無菌水沖洗3次后得到無菌根系樣品。根際土與根系保存于-80℃，用于微生物測序試驗(yàn)。根際土外土壤樣品為根圍土，過30目篩，一部分風(fēng)干后用于測定AMF孢子密度和土壤理化性質(zhì)，另一部分4℃保存，測定AMF菌絲密度。

圖1 引種地大花黃牡丹根系分布剖面圖（A、B）（2021年10月）及根系分布示意圖（C）Fig.1 Root distribution profile(A，B)（Oct.2021）and diagrammatic sketch(C)of P.ludlowii in introduction area

1.2 土壤理化性質(zhì)

各指標(biāo)測定均參考聶立水和王登芝方法[18]，土樣自然風(fēng)干后過篩，pH計(jì)（上海三信MP523-01）測定土壤pH，重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定土壤總有機(jī)質(zhì)，凱氏定氮法測定土壤總氮，靛酚藍(lán)比色法測定土壤銨態(tài)氮，碳酸氫鈉浸提法測定土壤有效磷，乙酸銨浸提-火焰光度法測定土壤速效鉀。

1.3 根圍土AMF孢子密度與菌絲密度

濕篩傾析蔗糖梯度離心法測定孢子數(shù)量，計(jì)算根圍土中AMF孢子密度，以每10 g風(fēng)干土樣中含有孢子數(shù)表示；臺盼藍(lán)染色-交叉計(jì)數(shù)法測定菌絲密度，顯微鏡（奧林巴斯CX33 200倍）下觀察25個(gè)視野，計(jì)數(shù)交叉點(diǎn)后計(jì)算菌絲密度[19]。

1.4 微生物測序

使用土壤DNA提取試劑盒（Mobio公司Power-Soil?DNA Isolation Kit）提取根際土和根系DNA，Thermo公司NanoDrop 2000檢測DNA濃度和純度，所有樣品濃度達(dá)10 ng·μL-1，且OD260/OD280為1.8~2.0，保證DNA提取質(zhì)量合格，可作擴(kuò)增試驗(yàn)。細(xì)菌采用16SrRNA基因擴(kuò)增通用引物515F（5′GTGC CAGCMGCCGCGGTAA 3′）和806R（5′GGACTACHV GGGTWTCTAAT 3′）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.5μL，10×PCR緩沖液5μL，核苷酸混合物（2.5 nmol·μL-1）5μL，正、反向引物(10μmol·L-1）各1μL，模板DNA（20~30 ng·μL-1）1μL，超純水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃1 min；94℃20 s，57℃25 s，68℃45 s，30個(gè)循環(huán)；68℃10 min。真菌采用ITS基因擴(kuò)增通用引物gITS7（5′GTGARTCATCGARTCTTTG 3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTTATTGATGC 3′）擴(kuò)增ITS區(qū)。PCR反應(yīng)體系與16SrRNA基因擴(kuò)增反應(yīng)體系相同。PCR反應(yīng)條件：94℃1 min，95℃20 s，57℃25 s，72℃45 s，循環(huán)35次；72℃10 min。AMF采用巢氏擴(kuò)增，第一輪引物選取NS31（5′TTGG AGGGCAAGTCTGGTGCC 3′）和AML2（5′GAACC CAAACACTTTGGTTTCC 3′）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱3 min；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。第1輪PCR產(chǎn)物稀釋至1/10作為第2輪PCR模板。AMV4.5NF（5′AAGCTCGTAGTTGAATTTCG 3′）和AMDGR（5′CCCAACTATCCCTATTAATCAT 3′）作為第二輪擴(kuò)增引物，其中AMDGR 5′端帶有由12個(gè)堿基組成的barcode，第2輪PCR反應(yīng)條件與第1輪PCR相同。所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，時(shí)間30 min），檢測后送至廣東美格基因科技有限公司作Illumina MiSeq測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

測序數(shù)據(jù)上傳至中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心宏基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建在Galaxy上的分析平臺（http://mem.rcees.ac.cn:8080）[20]。序列Reads根據(jù)標(biāo)簽被分配到不同樣品中并允許一個(gè)錯(cuò)配發(fā)生，然后去掉標(biāo)簽和引物序列。使用FLASH步驟合并相同序列正向和反向Reads。使用Btrim對Reads過濾，保持平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20，最小長度為140 bp。任何帶有簡并堿基序列均被刪除，僅保留長度為245~260 bp Reads后，使用Greengenes參考數(shù)據(jù)集作為嵌合體檢測的參考，使用UPARSE將序列聚類為可操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU），序列相似度閾值為97%[20]。AMF、16S和ITS分別使用Silva、RDP和UNITE數(shù)據(jù)庫對每個(gè)OTU進(jìn)行物種注釋。微生物α多樣性通過Shannon、Inv Simpson、Pielou evenness、Observed OTUs和Chao1指數(shù)表征，不同群落間差異通過非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS），微生物群落與土壤理化性質(zhì)之間相關(guān)性使用Mantel test確定，Excel 2016和SPSSStatistics 22分析數(shù)據(jù)，Thinkcell 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引種地大花黃牡丹根圍土理化性質(zhì)

由表1可知，引種地土壤有機(jī)質(zhì)含量較高，根據(jù)《土壤肥力分級表》[26]，引種地土壤養(yǎng)分級別為三級（中上），因地表枯枝落葉常年無人清理，上層有機(jī)質(zhì)含量高于下層。但表1也顯示引種地土壤N、P、K等養(yǎng)分含量較低，雖然上層高于下層，但各指標(biāo)在不同深度無顯著差異（P＞0.05），可能因引種地多年未施肥導(dǎo)致。

表1 引種地大花黃牡丹根系不同深度土壤理化性質(zhì)Table1 Physical and chemical propertiesof soil at different depths of Peonia ludlowii root in introduction area

2.2 引種地大花黃牡丹根際細(xì)菌與真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 根際細(xì)菌與根際真菌OTU組成與相對豐度

10個(gè)根際土樣本細(xì)菌與真菌分別得到620 079與669 570條優(yōu)化序列，97%相似水平聚類后得到9 989個(gè)細(xì)菌OTUs和2 212個(gè)真菌OTUs。由圖2可知，上下兩層共有細(xì)菌OTU 2 746個(gè)，分別占上層和下層總OTUs54.27%和63.51%，上層根際土特有細(xì)菌種類比下層多；上下兩層共有真菌OTU 1 108個(gè)，分別占上層和下層總OTUs48.09%和48.88%。

圖2 引種地大花黃牡丹不同深度根際土特有和共有細(xì)菌（A）和真菌（B）OTUs韋恩圖Fig.2 Bacteria(A)and fungi(B)OTUs Venn diagram of rhizosphere soil in different depth of P.ludlowii in introduction area

細(xì)菌所有序列經(jīng)注釋后被分類為26門67綱512屬，門水平上相對豐度高于1%菌門，如圖3（A）所示。不同深度優(yōu)勢菌門相似，其中變形菌門（Proteobacteria）優(yōu)勢最大，上層和下層相對豐度分別為67.80%和71.18%。其他優(yōu)勢菌門中，放線菌門（Actinobacteria）在上層相對豐度（9.19%）與下層（10.10%）接近，酸桿菌門（Acidobacteria）在上層相對豐度（6.29%）高于下層（4.95%），擬桿菌門（Bacteroidetes）在上層相對豐度（6.29%）高于下層（4.95%）。如圖3（B）所示，屬水平上最有優(yōu)勢類群為假單胞菌屬（Pseudomonas），在上層和下層相對豐度分別為47.85%和55.15%。

圖3 引種地大花黃牡丹不同深度土層根際細(xì)菌在門水平（A）和屬水平（B）相對豐度Fig.3 Relativeabundanceof rhizospherebacteria community at thephylum level(A)and thegenuslevel(B)in different soil depth of P.ludlowii in introduction area

真菌經(jīng)注釋后分為15門58綱712屬，門水平上相對豐度高于1%類群如圖4（A）所示。其中子囊菌門（Ascomycota）相對豐度最高，上層和下層分別為42.17%和43.68%，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在上層相對豐度（19.42%）低于下層（26.99%）。此外，上層根際土中檢測到捕蟲霉門（Zoopagomycota）、Aphelidiomycota、隱真菌門（Rozellomycota）和蛙糞霉門（Basidiobolomycota）4門，下層未檢測到。

如圖4（B）所示，屬水平上，被孢霉屬（Mortier?ella）在上層和下層相對豐度相近，分別為8.62%和8.67%。莫氏黑粉菌屬（Moesziomyces）在上層相對豐度（3.37%）低于下層（9.73%），但緣刺盤菌屬（Cheily?menia）相對豐度（7.16%）高于下層（1.56%）。但占比最大是未分類屬（Unclassified）。

圖4 引種地大花黃牡丹不同深度土層根際真菌在門水平（A）和屬水平（B）相對豐度Fig.4 Relativeabundanceof rhizospherefungicommunity at thephylum level(A)and thegenuslevel(B)in different soil depth of P.ludlowii in introduction area

2.2.2 根際細(xì)菌與真菌α多樣性

根際細(xì)菌在上層土壤觀測豐富度（Observed OTUs）和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)高于下層，上層根際細(xì)菌豐富度更高，但上下兩層無顯著差異（P＞0.05）。其余多樣性指數(shù)均為上層低于下層，層間無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.3 根際細(xì)菌與真菌β多樣性

NMDS分析是群落β多樣性常用分析方法，其對樣本群落進(jìn)行降維排序，在二維平面上判斷樣本之間關(guān)系，同組樣本點(diǎn)距離遠(yuǎn)近說明樣本重復(fù)性強(qiáng)弱，不同組樣本遠(yuǎn)近則反應(yīng)組間樣本差異?；贐ray-Curtis距離NMDS分析結(jié)果見圖5，不同深度根際細(xì)菌與根際真菌群落均有重合，差異較小。

表2 引種地大花黃牡丹不同深度土層根際細(xì)菌與真菌多樣性Table 2 Diversity of rhizosphere bacteria and fungiin different depth of P.ludlowii in introduction area

圖5 引種地大花黃牡丹不同深度根際細(xì)菌（A）和真菌（B）群落結(jié)構(gòu)NMDS分析Fig.5 NMDSanalysisof rhizospherebacteria(A)and fungi(B)community structurein different depth of P.ludlowii in introduction area

2.3 引種地大花黃牡丹根際和根系A(chǔ)MF多樣性與群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 根圍土AMF孢子密度與菌絲密度

大花黃牡丹上、下層根際土中均存在AMF孢子和菌絲，上層土中孢子密度和菌絲密度均高于下層，但二者并無顯著差異（P＞0.05）。

表3 引種地大花黃牡丹不同深度根際土AMF孢子密度與菌絲密度Table3 AMFSporedensity and hyphal length density of rhizosphere soil in different depth of P.ludlowii in introduction area

2.3.2 根際土和根系A(chǔ)MF的OTU組成與相對豐度

對上、下層根際土和根系A(chǔ)MF高通量測序共得到92 079條優(yōu)化序列，在97%相似水平將所有序列聚類為116個(gè)OTUs。其中，根際土中合計(jì)48個(gè)，上、下層分別為37個(gè)和27個(gè)，兩層共有OUT為16個(gè)；根系中提取到110個(gè)OTUs，上、下層分別為88個(gè)和101個(gè)，兩層共有OTU為79個(gè)；根際土與根系共有OTU為42個(gè)（見圖6）。

圖6 引種地大花黃牡丹不同深度根系與根際土特有和共有AMF OTUs韋恩圖Fig.6 Special and common AMF OTUs Venn diagram of root and rhizosphere soil in different depth of P.ludlowii in introduction area

除未確定分類地位OTUs，所有根系和根際土樣品AMFOTUs分屬于球囊菌門（Glomeromycota）球囊菌綱（Glomeromycetes）4目7科10屬。根系與根際土AMFOTUs在屬水平相對豐度如圖7所示，球囊菌綱未分類屬（Glomeromycetes_unclassified）相對豐度最高，在根際土和根系中均達(dá)到60%以上；近明球囊霉屬（Claroideoglomus）在根際土中相對豐度（22.72%）高于根系中（8.90%），隔球囊霉屬（Septoglomus）在根際土（10.66%）和根系（15.41%）中相對豐度相近。球囊霉屬（Glomus）在根際土中相對豐度為4.09%，而在根系中并未檢測到。

圖7 引種地大花黃牡丹屬水平根系與根際土AMF相對豐度Fig.7 Relative abundance at the genus level of AMF community in root and rhizosphere soil of P.ludlowii in introduction area

如圖8所示，在根系中，近明球囊霉屬上層相對豐度（16.43%）高于下層（0.98%），隔球囊霉屬則下層（26.14%）高于上層（5.22%），差異明顯；根際土中，近明球囊霉屬上層相對豐度（16.62%）低于下層（29.71%），而隔球囊霉屬上層相對豐度（12.63%）高于下層（8.40%），類球囊霉屬（Paraglomus）下層相對豐度為16.02%，遠(yuǎn)高于上層（2.93%）。

圖8 引種地大花黃牡丹不同深度土層根際AMF在屬水平相對豐度Fig.8 Relative abundance of AMF community at thegenuslevel in different depth of P.ludlowii in introduction area

2.3.3 根際土與根系A(chǔ)MFα多樣性

引種地大花黃牡丹根系中AMF多樣性分析（見表4）表明，各項(xiàng)指數(shù)均為下層大于或等于上層，根系A(chǔ)MF多樣性在下層較高，層間差異卻并不顯著（P＞0.05）。根際土中AMF多樣性分析則表明，多樣性指數(shù)均為上層大于或等于下層，說明接近表層的根際土中AMF多樣性更高且可能存在更多稀有種類，但層間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 引種地大花黃牡丹不同深度根系與根際土AMF多樣性Table4 AMFdiversity of root and rhizospheresoil in different depth of P.ludlowii in introduction area

上層中根系A(chǔ)MF多樣性指數(shù)均為根際土高于根系；在下層中，除Chao1外，其余多樣性指數(shù)均為根際土低于根系，但均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.4 根際土與根系A(chǔ)MFβ多樣性

分析引種地大花黃牡丹不同深度根系和根際土AMF群落之間差異性，基于Bray-Curtis距離NMDS分析如圖9所示。根系與根際土AMF群落之間并無重合，說明根系與根際土AMF群落結(jié)構(gòu)差異較大，不同深度根系或不同深度根際土群落間差異較小。上下兩層根際土AMF群落重合度較高，上下兩層根系中AMF群落也有部分重合。

圖9 引種地大花黃牡丹不同深度根系與根際土AMF群落結(jié)構(gòu)NMDS分析Fig.9 NMDSanalysis of AMF community structure in root and rhizospheresoil in different depth of P.ludlowii in introduction area

2.4 根際微生物群落與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性

基于Bray-Curtis距離Mantel分析結(jié)果見表5，土壤pH與根際細(xì)菌群落顯著相關(guān)（P=0.022）；土壤有機(jī)質(zhì)含量與AMF群落顯著相關(guān)（P=0.032），速效鉀含量與AMF群落顯著相關(guān)（P=0.043），銨態(tài)氮含量與AMF群落極顯著相關(guān)（P=0.009）。

表5 土壤理化性質(zhì)與根際微生物群落之間Mantel分析結(jié)果Table5 Mantel-test resultsbetween rhizosphere microbial community and chemical propertiesof soil

3 討論與結(jié)論

3.1 大花黃牡丹根際細(xì)菌群落

Lu等在大花黃牡丹結(jié)果期調(diào)查其在原產(chǎn)地林芝根際細(xì)菌，將本文結(jié)果與其對比發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是原產(chǎn)地和欒川引種地門水平上共有優(yōu)勢根際細(xì)菌類群，假單胞菌屬是兩地屬水平上共有優(yōu)勢根際細(xì)菌類群[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，引種栽培大花黃牡丹上層土壤根際細(xì)菌豐富度較高，與Lu等結(jié)果一致，且根際細(xì)菌在上層土壤中比下層具有更多特有種類，這可能與引種地大花黃牡丹吸收根在0~10 cm土層分布較多有關(guān)。

引種地根際細(xì)菌觀測豐富度（1 797~1 937種）低于原產(chǎn)地（2 832~3 065種），兩地相對豐度最高類群均為變形菌門，但其在引種地相對豐度（67.80%~71.18%）遠(yuǎn)高于原產(chǎn)地（21.2%~31.1%）[21]，推測引種地根際細(xì)菌類群趨向單一化。作物生長發(fā)育、抗病性與其根際細(xì)菌群落有關(guān)，如‘鳳丹’牡丹（P.ostii′Fengdan′）連作后，根際細(xì)菌群落多樣性和部分細(xì)菌菌群相對豐度逐年降低，真菌群落多樣性隨種植年限增加先升后降，且群落結(jié)構(gòu)變化顯著[22-23]。而徐紅梅等發(fā)現(xiàn)芍藥（P.lactiflora）種植年限增加時(shí)，根際細(xì)菌多樣性上升，且根際細(xì)菌和真菌優(yōu)勢種類變化均較小，并認(rèn)為這可能是芍藥不產(chǎn)生連作障礙的原因[24]。本文大花黃牡丹在引種地連續(xù)栽植近20年，且多年未追肥，土壤中N、P、K含量較低，生長已逐漸衰弱，這一趨勢與引種地土壤根際微生物群落變化關(guān)系有待深入研究。本文發(fā)現(xiàn)引種地土壤pH與根際細(xì)菌具有顯著相關(guān)性（P=0.022），今后可探討調(diào)節(jié)土壤pH對大花黃牡丹根際細(xì)菌群落多樣性的影響，以期為改善大花黃牡丹栽培管理措施提供指導(dǎo)。

3.2 大花黃牡丹根際真菌群落

對比祿亞洲等研究發(fā)現(xiàn)，欒川引種地與西藏原產(chǎn)地有共同根際土壤真菌優(yōu)勢類群，即子囊菌門和擔(dān)子菌門，原產(chǎn)地土壤真菌標(biāo)志性類群叢赤殼科（Nectriaceae）在引種地也有檢出[25]。原產(chǎn)地大花黃牡丹根部內(nèi)生真菌物種豐富，不同深度根際土真菌群落組成相似，且具有相似的豐富度和多樣性。本研究也發(fā)現(xiàn)引種后大花黃牡丹不同深度根際真菌群落組成和結(jié)構(gòu)相似，多樣性指數(shù)（Shannon、Inv Simpson、Pielou evenness、Observed OTUs

和Chao1）在不同深度無顯著差異。引種地具有與原產(chǎn)地相同的根際真菌類群及相似的真菌群落組成和結(jié)構(gòu)，有助于引種后大花黃牡丹生長發(fā)育。從屬水平上看，原產(chǎn)地根際真菌優(yōu)勢屬為濕傘屬（Hygrocybe）和被孢霉屬[25]，而欒川引種地優(yōu)勢屬為被孢霉屬和莫氏黑粉菌屬，兩地共同優(yōu)勢屬為被孢霉屬，這一結(jié)果為分析影響大花黃牡丹引種栽培后生長發(fā)育的關(guān)鍵根際微生物類群提供基礎(chǔ)，今后需結(jié)合兩地自然環(huán)境和大花黃牡丹不同發(fā)育階段、生長季節(jié)等因素深入挖掘相關(guān)類群。

本研究發(fā)現(xiàn)引種地大花黃牡丹吸收根主要分布在上層，捕蟲霉門、Aphelidiomycota、隱真菌門和蛙糞霉門等4門真菌也僅見于上層根際土，是上層根際土中特有真菌類群。引種地因疏于管理，土壤中N、P、K含量低，因此這4門真菌可能促進(jìn)大花黃牡丹根系對水肥的吸收。

植物生長發(fā)育不同時(shí)期影響根際微生物群落組成[26]，本文與Lu等均在大花黃牡丹果期取樣[21]，建議今后對比大花黃牡丹在原產(chǎn)地和引種地根際微生物研究中，兩地取樣時(shí)期保持一致。

3.3 大花黃牡丹根際土與根系A(chǔ)MF

我國芍藥屬根際微生物研究最初集中于AMF。郭紹霞調(diào)查栽培牡丹AMF種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)球囊霉屬為中原牡丹品種群優(yōu)勢屬[27]，且將地表球囊霉（G.versiforme）和摩西球囊霉（G.mosseae）回接侵染‘鳳丹’牡丹后，其耐鹽性顯著提高[28]。四川牡丹（P.decomposita）根際土中球囊菌門微生物相對豐度低于1%[29]，但由于該研究對DNA擴(kuò)增區(qū)域?yàn)檎婢鶬TS區(qū)，對AMF類群可能無法充分?jǐn)U增，四川牡丹AMF資源豐富程度有待進(jìn)一步明確。本研究發(fā)現(xiàn)引種地大花黃牡丹根際存在廣譜菌根真菌無梗囊霉屬（Acaulospora），但相對豐度較低。任鴻雁發(fā)現(xiàn)卵葉牡丹（P.qiui）實(shí)生苗接種蜜色無梗囊霉（A.mellea）可促進(jìn)其地上和地下部分生長并抑制Cu和Fe吸收[30]。后續(xù)可分析野生牡丹與栽培牡丹招募球囊霉屬能力差異，分離引種地?zé)o梗囊霉屬和球囊霉屬菌株，回接、侵染引種植株，從中篩選有顯著促生作用的AMF菌種。

原產(chǎn)地大花黃牡丹AMF多樣性和群落結(jié)構(gòu)尚未見報(bào)道。定殖于引種地大花黃牡丹根際土和根系中AMF優(yōu)勢類群相似，OTUs也有重疊，這是由于AMF被宿主植物招募后首先定殖于植物根際，進(jìn)而進(jìn)入根系內(nèi)部，但根際土與根系A(chǔ)MF群落結(jié)構(gòu)存在差異，上層根系內(nèi)AMF群落更接近根際土AMF群落，可能與土壤環(huán)境與根內(nèi)環(huán)境差異有關(guān)。本研究中，上層根際土AMF多樣性高于下層，同時(shí)對AMF鏡檢結(jié)果表現(xiàn)為上層根圍土AMF孢子密度和菌絲密度均高于下層。

本研究檢測到大花黃牡丹根際土及根系中未分類微生物較多，其中AMF未分類屬相對豐度最高，今后可深入分析并明確其分類地位，探索大花黃牡丹特有根際微生物種類，從這一角度闡明其狹窄的地理分布特征及瀕危原因。

3.4 非微生物因素對大花黃牡丹引種栽培的影響

河南省洛陽市欒川縣芍藥科遷地保護(hù)圃是我國目前引種栽培大花黃牡丹數(shù)量最多的遷地保護(hù)圃。氣候、土壤等自然環(huán)境適宜是其引種栽培較為成功的因素之一[12-13]。土壤理化性質(zhì)與根際微生物群落相關(guān)，馮瑋娜和彭培好發(fā)現(xiàn)四川牡丹根際土有機(jī)碳、氮、磷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)等土壤理化性質(zhì)影響不同生境四川牡丹根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)[29]，與本文研究結(jié)果一致。本研究中，引種地土壤N、P、K等養(yǎng)分含量較低，而大花黃牡丹原產(chǎn)地林芝土壤養(yǎng)分豐富，有機(jī)質(zhì)（＞40.00 g·kg-1）、全氮（1.31~4.98 g·kg-1）、有效磷（27.82~94.38 mg·kg-1）和速效鉀（50.59~311.36 mg·kg-1）含量均高于引種地[25]，其中有效磷和速效鉀含量遠(yuǎn)高于引種地。因此，加強(qiáng)大花黃牡丹引種栽植地土壤養(yǎng)分管理，有利于引種后根際土壤微生物群落定殖并形成與原產(chǎn)地相似的群落組成和結(jié)構(gòu)，更好促進(jìn)引種地大花黃牡丹生長。

本研究對河南欒川引種地大花黃牡丹根際微生物群落分析尚不足以深入闡明其引種前后根際微生物作用及對生長發(fā)育的長期影響，今后可關(guān)注欒川引種地與原產(chǎn)地共有根際微生物種類，以及其他引種地，特別是屢次引種大花黃牡丹但無法正常生長的種植圃情況，對比其與原產(chǎn)地及大花黃牡丹不同生長發(fā)育期根際微生物優(yōu)勢類群和環(huán)境影響因子，以期為大花黃牡丹引種、遷地保護(hù)和資源利用提供參考和依據(jù)。

4 結(jié)論

引種栽植地大花黃牡丹根際微生物資源豐富，細(xì)菌與真菌分別得到9 989與2 212個(gè)OTUs；根際細(xì)菌分屬于26門67綱512屬，變形菌門相對豐度最高；根際真菌分屬于15門58綱712屬，子囊菌門與擔(dān)子菌門為優(yōu)勢類群。根系與根際土中共提取到116個(gè)AMF OTUs，分屬于球囊菌門球囊菌綱的4目7科10屬，近明球囊霉屬與隔球囊霉屬為優(yōu)勢類群；基于Bray-Curtis距離NMDS分析結(jié)果表明，根系和根際土AMF群落結(jié)構(gòu)差異較大。根際細(xì)菌、真菌和AMF三類根際微生物在引種后不同深度土壤中，群落差異均不顯著。土壤有機(jī)質(zhì)含量、銨態(tài)氮含量、速效鉀含量和pH與根際微生物群落存在顯著相關(guān)。變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是原產(chǎn)地和欒川引種地共有優(yōu)勢根際細(xì)菌類群，子囊菌門和擔(dān)子菌門是兩地共有根際土壤真菌優(yōu)勢類群。