過敏性紫癜患兒血清microRNA-6769b-5p的表達及與IL-10相關(guān)性

李靜

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，遼寧 錦州 121000)

過敏性紫癜(HSP)作為兒童常發(fā)病的免疫性疾病之一，對稱分布的紫紅色紫癜是其重要特征，同時伴有消化道癥狀和關(guān)節(jié)癥狀及腎臟損害。已知HSP發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)導(dǎo)致免疫復(fù)合物在血管壁上沉積，該過程可能激活中性粒細(xì)胞并增強炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而引起組織損傷[1]。目前為止，HSP的發(fā)病發(fā)病機制仍然不清。

微小RNA(microRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA。microRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達，發(fā)揮多種功能。microRNA在很多疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，特別是在免疫系統(tǒng)中起重要作用[2]。據(jù)報道，microRNA的失調(diào)與自身免疫性疾病(例如哮喘、特應(yīng)性皮炎)有關(guān)和變應(yīng)性鼻炎。然而，我們對microRNA在HSP中的作用仍然知之甚少。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)在HSP發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，并是microRNA-6769b-5p的靶基因[3]。IL-10由輔助型T細(xì)胞、活化的B細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌，發(fā)揮多種生物學(xué)活性的炎癥因子。在炎癥反應(yīng)過程中，IL-10可抑制單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1、IL-6、IL-8等多種炎癥介質(zhì)，從而發(fā)揮較強的抗炎作用[4]。因此，在這項研究中，我們旨在介紹HSP患兒microRNA-6769b-5p及其與IL-10水平相關(guān)性的研究，以期尋找新型炎性生物標(biāo)志物，從而在HSP治療和預(yù)防中發(fā)揮重要作用。

1 資料和方法

1.1 研究對象

以2018年1月1日至2018年5月22日期間在某醫(yī)院兒科被診斷為HSP兒童45名為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2013年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會免疫學(xué)組修訂的HSP診治循證指南；(2)患有其他腎臟疾病，幽門螺旋桿菌感染、全身性炎癥或自身免疫性疾病的患者被排除在外，并除外入組前15 d內(nèi)接受任何治療的患兒；(3)選取同期兒保門診體檢的27名健康兒童作為對照組。該研究獲得某醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：202024)，并獲得所有參與者監(jiān)護人的同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRCR)：使用總RNA提取試劑盒(北京，天根)從外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中提取總RNA。RNA被逆轉(zhuǎn)錄后通過實時定量熒光定量分析法測定hsa-miR-6769b-5p的水平。正向引物：TGGTGGGTGGGGAGGAGA，反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGTATTC。U6snRNA充當(dāng)內(nèi)源性控制。使用2-ΔCt方法計算miR-6769b-5p的水平。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：采用ELISA方法，使用人IL-10 ELISA試劑盒測定血清IL-10濃度(武漢中美科技有限公司)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析(GraphPad軟件，美國加利福尼亞州圣地亞哥)。定量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較使用t檢驗。定性資料以百分比(%)表示，使用χ2檢驗進行組間比較。Spearman相關(guān)分析用于確定miR-6769b-5p與IL-10之間的相關(guān)性。曲線下面積(AUC)值根據(jù)ROC曲線確定。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSP患兒血清microRNA-6769b-5p的表達

為了分析HSP兒童中的microRNA-6769b-5p的表達水平，進行了實時熒光定量PCR檢測。與健康對照相比，microRNA-6769b-5p在HSP組中表達下調(diào)(P=<0.05)，見圖1。

***P<0.05

2.2 microRNA-6769b-5p在HSP兒童血清中的表達

microRNA-6769b-5p水平在HSP兒童的PBMCS中表達為下調(diào)。通過ROC曲線，與健康兒童相比較，microRNA-6769b-5p的水平在HSP兒童中表達具有特異性，AUC為0.883，P<0.001，見圖2。以上結(jié)果表明，在HSP兒童中，microRNA-6769b-5p 發(fā)生改變，并且可能具有將HSP兒童與健康兒童區(qū)分開來的潛力。除此之外，我們還分析了HSP兒童中不同臨床表現(xiàn)，例如皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)炎和/或關(guān)節(jié)痛、胃出血、首發(fā)或是復(fù)發(fā)病例數(shù)中microRNA-6769b-5p的表達水平。結(jié)果提示microRNA-6769b-5p的表達水平與腹痛具有相關(guān)性，見表1，更多患兒血清中出現(xiàn)microRNA-6769b-5p的高水平表達(AUC為0.094，P<0.001)，見圖3。

2.3 HSP患兒中IL-10對HSP患兒腹痛預(yù)測

我們分析IL-10對HSP患兒腹痛沒有預(yù)測價值，AUC為0.504，P>0.001，見圖4。

2.4 HSP患兒中microRNA-6769b-5p與IL-10的相關(guān)性分析

我們分析了HSP患兒中microRNA-6769b-5p與IL-10之間是否具有相關(guān)性，見圖5，R=0.03,P=0.856，不具有相關(guān)性。

表1 HSP患兒臨床表現(xiàn)與血清microRNA-6769b-5的表達水平

圖2 microRNA-6769b-5p 的表達水平與診斷HSP的相關(guān)性

圖3 HSP患兒腹痛癥狀與microRNA-6769b-5p 水平的相關(guān)性

圖4 HSP患兒中腹痛癥狀與IL-10水平的相關(guān)性

圖5 microRNA-6769b-5p表達 和 IL-10水平的相關(guān)性

3 討 論

作為兒科常見的一種以小血管炎為主要病變的疾病之一，HSP的發(fā)病機制與機體免疫功能失衡、感染或是接觸一些誘發(fā)因素有關(guān)，約33%的HSP患兒有復(fù)發(fā)傾向[5-6]。microRNA是一組內(nèi)源性非編碼小片段基因，是調(diào)控基因表達不可或缺的因子,其不僅在細(xì)胞分化、凋亡及增殖等過程起到重要的調(diào)節(jié)作用,而且在免疫系統(tǒng)的發(fā)育中起著核心作用[7]。免疫系統(tǒng)功能障礙，可以導(dǎo)致microRNA在體內(nèi)異常表達[8]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在某些疾病中可以用作診斷性生物標(biāo)志物，例如癌癥，心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9]。迄今為止，microRNA在HSP兒童中的作用機制尚不清楚。VEGFA又稱血管通透性因子，作用非常廣泛，就如它的名字一樣，能夠增強血管的通透性，自身還具有改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，維持血管內(nèi)皮完整性，適當(dāng)調(diào)節(jié)血管的血流量，并對肥大細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用[10]。VEGFA是microRNA-6769b-5p的靶基因，microRNA-6769b-5p在肝硬化中高表達[11]，microRNA-6769b-5p/VEGFA 軸之間的相互作用可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)展中起重要作用[12]。但在HSP中表達尚不可知。本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-6769b-5p在HSP患兒中呈現(xiàn)低表達，提示microRNA-6769b-5p參與了血管炎癥反應(yīng)過程，可能形成免疫復(fù)合物在血管內(nèi)壁堆積造成組織損傷，由此推斷其可能與HSP的發(fā)病機制有關(guān)。

我們分析了microRNA-6769b-5p和HSP患兒的臨床特征。除了性別和年齡，microRNA-6769b-5p的水平與腹痛有關(guān)，表明microRNA-6769b-5p的下調(diào)可能與HSP兒童的腹痛有關(guān)。腹型過敏性紫癜以消化道癥狀為首發(fā)，主要表現(xiàn)為腹痛，腹痛部位可以波及腹部任何部位，可呈現(xiàn)陣發(fā)性臍周絞痛，伴有壓痛，反跳痛較少見。腹部癥狀可以在特征性的紫癜出現(xiàn)以前發(fā)生，大部分腹痛出現(xiàn)在皮疹7 d之內(nèi)。腹痛的程度可類似于任何的急腹癥，同時伴有嘔吐，50%的患兒出現(xiàn)血便或嘔血或僅僅為大便隱血陽性。如果腹部癥狀出現(xiàn)在皮疹以前，容易誤診為外科急腹癥，如急性闌尾炎等。這種癥狀主要是由于腸系膜血管炎引起粘膜下出血和腸壁水腫。有報道說microRNA-6769b-5p促進了強大的促炎活性的促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的增加[13]。因此，我們推測microRNA-6769b-5p在血液中的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生作用可能會導(dǎo)致其與腹痛相關(guān)。結(jié)果表明，microRNA-6769b-5p抑制物可能成為緩解HSP期間腹痛癥狀的有效藥物，當(dāng)然，這個假設(shè)需要進一步驗證。

IL-10對多種免疫細(xì)胞發(fā)揮著免疫抑制作用，是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，防止和抑制強大的特異和非特異性免疫反應(yīng)，及由此引起的組織損傷是其重要的生理意義,同時IL-10有助于誘導(dǎo)免疫耐受，并可加強“清道夫”功能。鑒于IL-10的分子機制和生物學(xué)特征,故本實驗著力研究IL-10相關(guān)性疾病的免疫治療有重要意義[14]。作為一種炎癥疾病，HSP患者中血清和尿液中IL-10水平升高[15]。還有學(xué)者研究小鼠輸卵管積水模型發(fā)現(xiàn)IL-10通過抑制炎癥因子IFN-γ和IL-2的表達，降低宿主清除衣原體能力,加重輸卵管積水的發(fā)病率[16]。另外李云華等[17]研究報道牙周炎組患者齦溝液中IL-10含量顯著低于健康對照組，輕度牙周炎組患者齦溝液中IL-10含量低于重度牙周炎患者，且治療后牙周炎組齦溝液中IL-10含量明顯升高。膿毒血癥患者血清中IL-10水平呈高表達，加速疾病的進展，因此，在疾病早期檢測IL-10，可以作為膿毒血癥的早期診斷指標(biāo)，對于疾病的預(yù)后判斷也有一定的指導(dǎo)意義[18]。有研究證明，microRNA與IL-10存在密切關(guān)系。例如microRNA-19a抑制動脈粥樣硬化患者外周B細(xì)胞中的IL-10[19]。沉默microRNA-21通過促進產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的分化來改善自身免疫性腦脊髓炎[20]。Micro RNA-98抑制心臟移植術(shù)后患者外周B細(xì)胞中的IL-10[21]。本研究中HSP患兒中的microRNA-6769b-5p與血清IL-10無相關(guān)性。因此，還需要實驗進一步證實HSP的發(fā)病機制。

綜上所述，通過研究microRNA-6769b-5p表達及其與血清IL-10在HSP患兒血清中的相關(guān)性，使我們更好的了解microRNA-6769b-5p在HSP中的所發(fā)揮的作用。盡管未發(fā)現(xiàn)microRNA-6769b-5p與血清IL-10具有相關(guān)性，但是microRNA-6769b-5p作為抑炎因子對于HSP的診斷、預(yù)后具有一定的臨床價值，鑒于HSP在兒童中發(fā)病率逐漸增加，我們后續(xù)實驗將繼續(xù)研究其他microRNA在HSP患兒中的表達。