肝癌患者血清中LncRNA-ATB的表達

蔣磊，李玉強，李男，趙明洲，李巖，楊微微

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

肝細胞肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，研究數(shù)據(jù)顯示，目前肝癌相關死亡率高居癌癥相關性死亡原因第3位[1]。由于肝癌發(fā)病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，因此尋找并明確肝癌發(fā)生發(fā)展過程中新的治療靶點對于今后肝癌的診斷及治療過程中有著重要的意義。隨著人類基因組計劃的完成，近年越來越多的研究結果證實，長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的異常表達在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調控作用，有望成為肝癌診斷的生物標記以及新的治療靶點[2]。其中，lncRNA-ATB (long non-coding RNA active by TGF-β)作為新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA明星分子[3]，得到了越來越多的關注。

肝癌發(fā)生發(fā)展過程受到細胞內外多種因素的調控，尤其是近年來隨著研究的深入以及測序技術的迅猛發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明細胞中長鏈非編碼 RNA的異常表達與肝癌的發(fā)展密切相關[4]。因此研究二者之間的作用機制成為肝癌靶向治療研究的重要課題。Yuan 等[5]的研究發(fā)現(xiàn)并證實了 lncRNA-ATB 在肝癌中的表達及在肝癌 EMT 過程中發(fā)揮的作用。Tomoko Saito 等[6]證實 lncRNA-ATB 在胃癌組織中的表達以及其表達與侵襲以及預后的關系。Tomohiro 等[7]進一步證實 lncRNA -ATB 在結直腸癌中的表達及功能。這些結果均證實lncRNA-ATB 在多種腫瘤細胞中的表達具有重要的調控功能，因此探討 lncRNA-ATB 在血清中的表達具有重要的臨床意義。

國內外對于 lncRNA-ATB 的研究多集中在腫瘤細胞內部，對于其在腫瘤細胞外微環(huán)境中的作用，尤其在血中的作用及機制尚未完全闡釋清楚，本研究擬通過分析 lncRNA-ATB 在健康人群血清和肝癌患者術前、術后不同時期血清中的表達差異，明確血清中 lncRNA-ATB 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并將其作為診斷肝癌的分子生物學標志物，為靶向治療肝癌提供理論和實驗的基礎。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

在本次研究中，我們收集了某醫(yī)院2015年1月至2018年期間行確診肝癌患者血清(未進行化療與放療治療者)120例為實驗組，本研究中收集的所有病例均有詳細且完整的臨床病例資料(患者年齡，性別，腫瘤大小，分化程度，轉移情況TNM分期)；術前未行放化療等相關抗腫瘤治療；組織標本為手術切除后留取，且切緣為陰性；病理確診為肝細胞癌；所有患者均是首次確診且未合并其他腫瘤。在本研究中，收集健康體檢者(體檢科)的正常血清 90例作為對照(排除惡性腫瘤以及其他重要器官功能病變或受損)。所有納入項目者均已簽署知情同意書，同時本項目通過本院及學院倫理委員會的批準。

1.2 血清樣本采集及處理

納入本次研究的靜脈血全部經由病房護士留取，收取的所有血液標本均在冰盒中運輸，在2 h內離心(4 ℃，3500 rpm，10 min)，經離心后，小心吸取血清成分，分裝入 15 mL 無菌離心管中，裝入 -80 ℃ 冰箱中保存。按照說明書(QIAGEN)提取血清中的 RNA，RNA 濃度通過 NanoDrop1000 Spectrophotometer 測定，qPCR檢測血清中 lncRNA-ATB 的表達。

1.3 QPCR

血清中RNA 提取按說明書進行，本研究中所涉及的引物通過 Primer3 在線網站設計，real-time PCR 反應條件為 95 ℃ 30 s，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，42個循環(huán)后通過讀取實驗組與對照組中的 Ct 值，按2-△△Ct計算患者及健康者血清中 lncRNA 的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究中所涉及的數(shù)據(jù)通過 SPSS 17.0軟件進行處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較通過應用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料通過卡方檢驗比較差異，血清中 lncRNA 的表達在肝癌中診斷效能的比較應用受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)進行比較，所有統(tǒng)計學檢驗均以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 lncRNA-ATB 在肝癌組織中的表達

研究證實，多種 lncRNA 在腫瘤組織中的異常表達，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調控作用[4]。為了明確 lncRNA-ATB 在肝癌組織中的表達情況，我們檢測肝癌組織中及癌旁組織中 lncRNA-ATB 的表達以明確其表達差異。我們的結果發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，lncRNA-ATB 的表達較癌旁組織顯著增高，提示 lncRNA-ATB 可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著促癌基因的作用，我們的這一結果與 Yuan 等的研究結果一致[5]。肝癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB 的表達顯著高于癌旁組織，見圖1。

圖1 lncRNA-ATB 在肝癌組織與癌旁組織中的表達情況

2.2 lncRNA-ATB 在健康者與肝癌患者血清中的表達

研究證實血清中的 lncRNA 可以作為腫瘤患者的診斷標記物[8]。那么，肝癌患者血清中 lncRNA-ATB表達是否能夠成為肝癌患者診斷的標記物值得我們深入探討。我們收集了肝癌患者術前血清以及健康體檢患者的血清，通過檢測兩組患者血清中的 lncRNA-ATB明確其在肝癌早期診斷中的應用價值。結果證實，在肝癌患者的血清中 lncRNA-ATB 的表達較正常人血清中的表達顯著升高，二者之間比較差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。lncRNA-ATB 在肝癌患者血清中的表達顯著高于健康者血清中的表達，見圖2。

圖2 lncRNA-ATB 在肝癌患者血清與健康者血清中的表達

2.3 血清中l(wèi)ncRNA-ATB的表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系

為了進一步明確肝癌患者血清中 lncRNA-ATB 的表達在肝癌進展過程中發(fā)揮的重要作用，我們還分析了 lncRNA-ATB 的表達與肝癌臨床病理參數(shù)之間的關系。根據(jù) lncRNA-ATB 的中位表達將 lncRNA ATB分為高 lncRNA-ATB 表達組與低 lncRNA-ATB 表達組并進一步分析 lncRNA ATB 表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)之前的關系。我們發(fā)現(xiàn) lncRNA-ATB 的表達與肝癌患者的年齡，性別等參數(shù)無關，但是與患者的腫瘤大小、分化程度、TNM 分期等參數(shù)密切相關，見表1。

2.4 血清lncRNA-ATB 表達對肝癌診斷價值分析

既往的研究證實，多數(shù)肝癌患者就診時已屬晚期，喪失了手術機會，是導致肝癌患者預后不良的重要原因。那么 lncRNA-ATB 在肝癌診斷中是否具有潛在應用價值值得我們進一步分析明確。分析其在肝癌中患者中的表達及在診斷中的意義，我們的結果提示，應用血清中 lncRNA-ATB 的表達診斷肝癌患者的 AUC 為0.9462，見圖3。

圖3 血清中 lncRNA-ATB 在肝癌中的診斷價值

表1 肝癌患者血清中 lncRNA-ATB的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系

3 討 論

我國肝癌患者發(fā)病率每年都在增長[9]。肝癌患者早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已屬晚期，失去手術機會，同時肝癌缺少有效的治療手段，使得肝癌患者的生存率顯著降低。在精準醫(yī)療時代，我們需要更加努力找尋與肝癌相關的診斷標記物，為提高肝癌的診斷率提供新的實驗依據(jù)[10]。目前研究表明，lncRNA 在疾病的診斷中具有重要的潛力，有望成為新的腫瘤診斷標記物[11]。

lncRNA 其長度大于200 nt，是 RNA 聚合酶II 的轉錄產物，研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù) lncRNA 分布與細胞核中，少部分 lncRNA 特異性分布于細胞漿中[12-13]。 lncRNA 的二級結構包括雙莖結構以及3’端的三葉草結構。目前關于 lncRNA 的三級結構尚未確定，其結構分散，缺乏緊密連接的核心結構。隨著人們對 lncRNA 認識的深入，發(fā)現(xiàn) lncRNA 雖然不編碼蛋白，但是卻具有復雜的生物學功能，在疾病進展中發(fā)揮著重要作用[12，14-15]866-883。普遍的研究認為，lncRNA 有望在腫瘤診斷，精準靶向治療的應用中具有重要的潛力[16]。研究證實，H19[17]、FERL4[18]均能作為胃癌的診斷標記物。伴隨著測試技術的飛速發(fā)展，更多具有強大功能的 lncRNA 被發(fā)現(xiàn)，使得 lncRNA 從最初的“暗物質”成為如今的“明星分子”?；谶@些研究成果，我們認為 lncRNA 在血清中作為腫瘤早期診斷標記物是可行的。LncRNA-ATB 是位于 chr14(q11.2) 上的 poly(A) -陰性的 RNA[3]37-46。既往的研究證實 lncRNA-ATB 在肝癌侵襲轉移以及 EMT 過程中發(fā)揮著重要的調控作用，而且其表達上調與肝癌患者的預后不良密切相關[5]666-681。目前的研究多數(shù)集中在 lncRNA-ATB 功能及機制的研究，對于其在臨床診斷中作用的報道較少。為了探索lncRNA-ATB 在肝癌診斷中的作用，我們首先檢測了 lncRNA-ATB 在肝癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中 lncRNA-ATB 在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，這一結果與 Yuan 等的研究結果一致[5]666-681，同時這一結果也為進一步探討 lncRNA-ATB 在肝癌患者血清中的表達奠定了基礎。我們在血清中檢測 lncRNA-ATB 的表達證實 lncRNA-ATB 在肝癌患者的血清中較正常健康人的血清中表達顯著增高，分析血清中 lncRNA-ATB 的表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系證實 lncRNA-ATB 的表達與肝癌患者的年齡、性別等參數(shù)無關，但是與患者的腫瘤大小、分化程度、TNM 分期密切相關，這一結果提示 lncRNA-ATB 不僅參與了肝癌的進展，還有望成為肝癌診斷的新型標記物，同時也有作為肝癌分期標記物的潛在應用價值。為了進一步明確 lncRNA-ATB 在肝癌診斷中的價值，通過分析證實血清中 lncRNA-ATB 的表達量診斷肝癌的AUC 為 0.9462，這一結果說明外周血中 lncRNA-ATB 的表達在輔助肝癌診斷中具有確切的診斷效能。目前已有多個中心的研究證實血清中 lncRNAs 在腫瘤診斷中具有巨大的應用價值[19]，研究結果也為 lncRNA 在腫瘤診斷中的應用提供了新的實驗數(shù)據(jù)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織中 lncRNA-ATB 高表達，同時患者血清中的lncRNA-ATB 亦較健康者血清中表達升高，而且這種升高與肝癌的多個病理參數(shù)具有明顯相關性，同時還證實了 lncRNA-ATB 的表達對診斷肝癌具有較高的診斷效能，有望在臨床應用中作為肝癌診斷以及病情評估的新型標記物。