NLRP3炎癥小體在卵巢病理生理中的作用及其調控

畢菁菁 綜述 唐宗浩 審校

1.西南醫(yī)科大學 外國語學院（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學藥物研究中心（瀘州 646000）

炎癥反應是哺乳動物細胞應對外界病原體刺激的重要保護機制，而炎癥的過度激活與細胞功能紊亂密切相關。細胞通過模式識別受體（pattern-recognition re?ceptors，PRRs）識別內源性的損傷相關分子模式（dam?age-associated molecular patterns，DAMPs）和外源性的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pat?terns，PAMPs）引起細胞自身的免疫應答并激活炎癥反應。PRRs 分為定位于細胞膜的TLR 受體（Toll-like re?ceptor）、CLR受體（C-type lectin receptor）以及位于胞內的黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）和NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR）[1]。近年來的研究表明，NLR 誘導的炎癥小體激活在細胞的炎癥反應調節(jié)中起到重要作用。不同NLR 家族蛋白構成的炎癥小體對炎癥信號的識別能力存在明顯的差異。其中，NL?RP3炎癥小體是目前發(fā)現(xiàn)的能夠識別信號種類最多的炎癥小體類型[1]。

NLRP3 在多種人類以及嚙齒類動物的細胞中表達，并參與炎癥水平的調控[2]。近些年的證據顯示，炎癥小體的調控紊亂是導致糖尿病、癌癥、自身免疫性疾病等多種人類疾病形成、發(fā)展的重要機制[2]。然而長期以來，NLRP3在卵巢生理和病理中的作用并未被揭示。近期，有研究對NLRP3炎癥小體在卵巢中的作用進行了報道，顯示其在多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syn?drome，PCOS）和卵巢衰老中發(fā)揮重要作用[3-6]。同時，有研究表明NLRP3 在正常的卵泡發(fā)育中也起到一定作用[7]。這些研究為闡明卵巢相關疾病的病理機制以及治療手段的開發(fā)提供了新的思路。

1 炎癥小體的調控機制

1.1 NLRP3的激活步驟

NLRP3 的激活主要分為預激活（priming）和激活（activation）兩個步驟[2]。NLRP3炎癥小體的預激活和激活信號對于功能性NLRP3 炎癥小體的產生都是十分必要的。通常認為，靜息狀態(tài)下細胞中NLRP3 的水平不足以啟動炎癥小體的激活。同時，游離NLRP3 的LRR區(qū)域在靜息狀態(tài)下被泛素化無法進行寡聚化也是NLRP3 無法激活的重要原因[2]。因此，為了促進炎癥小體的激活需要在預激活信號的刺激下首先激活NLRP3的上游轉錄因子NF-κB，進而促進NLRP3 轉錄的水平的上調。這些預激活刺激包括IL-1R1、TLRs和NLRs的配體以及細胞因子受體TNFR1、TNFR2 的配體[8]。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）能夠通過非轉錄依賴的預激活信號誘導炎癥小體的激活，而無需誘導NLRP3水平的上調[9]。同時，預激活信號還能夠通過去泛素化酶BRCC3（在人體中為BRCC36）,將NLRP3 去泛素化促進其激活[10]。

在預激活信號刺激后，NLRP3 炎癥小體能夠被多種促炎信號所激活，包括離子濃度變化、溶酶體損傷、線粒體損傷與活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、ATP以及病原RNA等[2]。值得注意的是，NLRP3炎癥小體除受到促炎信號的調控外還受到自噬的調節(jié)，自噬調控紊亂是造成NLRP3 過度激活的重要因素[11]。目前的研究已經證實，自噬水平降低是造成NLRP3炎癥小體在糖尿病[11]、動脈粥樣硬化[12]以及自身免疫性疾病[13]中過度激活的重要原因。

1.2 ROS與線粒體損傷誘導的炎癥小體激活

ROS 是線粒體呼吸的副產物，細胞通過多種抗氧化機制將ROS水平維持在一定的范圍進而防止ROS失衡和氧化應激。目前的研究發(fā)現(xiàn)，代謝水平增加、缺氧以及一些外源性刺激引起的細胞應激都能夠導致線粒體的損傷以及ROS 水平的增加[14]。利用Complex I 或Complex III抑制劑處理細胞都能夠導致ROS水平增加以及NLRP3 炎癥小體的激活[15]。ROS 對NLRP3 炎癥小體的調控作用也在基因敲除中得到了進一步驗證，例如敲除人THP1 巨噬細胞或小鼠BMDMs（bone-mar?row-derived macrophages）細胞中的NLRP3后抑制線粒體呼吸鏈不會導致IL-1β的激活[15]。這些實驗直接證明了ROS 在NLRP3 炎癥小體激活中的作用。有意思的是，高濃度的線粒體解偶聯(lián)劑CCCP 處理并不會導致ROS 的明顯上升和NLRP3 的激活，而低濃度的CCCP處理則會引起NLRP3的激活，提示膜電位失衡的線粒體所產生的ROS 才能引起NLRP3 炎癥小體的激活[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ROS 水平過度上調是導致缺血再灌注后腦、心臟、血管以及睪丸組織NLRP3 炎癥小體激活的重要原因[16]。

目前，ROS 對NLRP3 炎癥小體的激活作用是否存在普遍性尚存在一定的爭議。例如，有研究表明抑制小鼠或人細胞中的NADPH 氧化酶卻并不影響NLRP3 炎癥小體的激活[17]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠缺血損傷模型中敲除NADPH氧化酶2（NOX2）能夠減少NLRP3在腦部損傷部位的表達并抑制NLRP3-TXNIP的結合[18]。然而在臍靜脈內皮細胞中卻并未觀察到類似現(xiàn)象，這一結果提示ROS 對NLRP3 的促進作用可能存在組織或細胞特異性[18]。有觀點認為，造成這一現(xiàn)象的原因是由于這些ROS 的產生并不依賴NADPH 氧化酶而是由線粒體所產生[19]。

1.3 溶酶體與NLRP3炎癥小體激活

溶酶體是細胞中多種水解酶的儲存場所，負責胞內冗余蛋白以及部分有害物質的降解。細胞通過自噬途徑將蛋白聚集體或微顆粒進行包裹運送至溶酶體降解從而避免對細胞造成損失。然而，一些無法降解的結晶成分被運送至溶酶體后會造成溶酶體功能的失常進而加劇其內容物的釋放。目前的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內β樣淀粉蛋白、膽固醇結晶以及鈣結晶體等微顆粒引起的溶酶體損傷與炎癥小體激活也存在密切聯(lián)系[20-21]。誘導溶酶體破裂會引起NLRP3炎癥小體的顯著激活，而通過巴伐洛霉素A抑制溶酶體酸化后能夠抑制溶酶體破裂引起的炎癥小體激活，表明溶酶體酸化是NLRP3激活的重要前提[22]。同時，也有證據顯示cathepsin B 在NLRP3 的激活中也起到促進作用，抑制cathepsin B 也能夠阻礙溶酶體引起的NLRP3 激活[21]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，除cathepsin B 外cathepsins C、L、S 以及Z 也參與了溶酶體引起的NLRP3 炎癥小體的激活[23]。但總體來說cathepsin B 是溶酶體促進炎癥小體激活的主要蛋白酶，通過基因敲除或siRNA沉默的方法抑制cathepsin B后刺激溶酶體能夠降低BMDM細胞中IL-1β的釋放[24]。

1.4 自噬與NLRP3炎癥小體激活

自噬是真核細胞內進化保守的自我分解代謝機制，在營養(yǎng)匱乏、缺氧等應激條件下細胞能夠通過誘導自噬水平的上升降解自身冗余的細胞器以及蛋白質從而維持細胞自身的正常功能[25]。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬對NLRP3 炎癥小體的激活也具有調控作用[26]。針對巨噬細胞的研究發(fā)現(xiàn)，誘導NLRP3炎癥小體激活后會促進自噬水平的上調。類似的，通過TLRs 配體誘導炎癥后自噬也能夠通過對pro-IL-1β的識別和降解阻礙NL?RP3 炎癥小體對炎癥的誘導，并且這一現(xiàn)象也在體內實驗中得到了進一步驗證[27]。NLRP3 炎癥小體的預激活信號和激活信號都能夠誘導自噬水平的上升。例如，預激活信號能夠通過促進TFEB的表達誘導自噬[28]，而包括ATP、尼日利亞桿菌在內的NLRP3 炎癥小體的激活信號也能夠對自噬起到誘導作用。分子機制研究表明，NLRP3 炎癥小體組裝后能夠被自噬相關蛋白p62所識別并將其包裹進自噬體降解[29]，這一現(xiàn)象也在LPS誘導的小膠質神經細胞炎癥中得到驗證[30]。炎癥小體中受體蛋白NLRP3的泛素化是其能夠被p62所識別的關鍵。自噬還能夠通過對ASC 的降解抑制炎癥小體的激活。例如，原卟啉鈷能夠通過誘導自噬降解ASC，而抑制自噬后原卟啉鈷對ASC 的作用消失[31]。RalB（RAS like proto-oncogene B）的表達在炎癥小體誘導的自噬體組裝中也起到重要作用。在營養(yǎng)不足條件下，RalB核苷酸交換引起的GTP-RalB與Exo84的結合為隔離膜的形成和成熟提供了重要平臺[32]。NLRP3激動劑處理能夠快速地引起小鼠BMDM 細胞中的RalB 核苷酸交換并促進RalB表達的增加，而利用siRNA敲低RalB則能抑制炎癥小體誘導的自噬以及IL-1β分泌[29]。除直接作用于炎癥小體外，自噬還能通過對損傷線粒體、ROS等炎癥小體上游信號的降解抑制NLRP3 炎癥小體的激活（圖1）。小鼠中LC3B 的敲除會導致受損線粒體的明顯聚集和胞內游離mtDNA 水平的增加，并且在LPS 刺激后NLRP3 水平以及炎癥水平均較正常鼠明顯增加[33]。Guo等發(fā)現(xiàn)穿心蓮內酯對結腸炎的抑制作用也與其對NLRP3炎癥小體的抑制有關，穿心蓮內酯通過誘導巨噬細胞內的線粒體自噬緩解線粒體膜電位的失衡從而抑制NLRP3的激活，而敲除Beclin1或抑制自噬后抗炎作用消失[34]。因此，在多種疾病或損失引起的炎癥小體激活中，誘導自噬成為抑制炎癥發(fā)展的重要手段。PINK1-parkin通路誘導的線粒體自噬能夠通過降解受損線粒體抑制ROS釋放來抑制造影劑引起的急性腎臟損傷[35]。同樣，利用缺氧誘導自噬也能夠緩解NLRP3激活導致的腸道炎癥[36]。值得注意的是，雖然自噬是抑制線粒體損傷以及ROS 過度釋放的重要機制，但對于NADPH氧化酶產生的ROS并不具有抑制作用[37]。

圖1 自噬對NLRP3炎癥小體激活的影響Figure 1 The effects of autophagy on inflammasome activation

與其在細胞生理中的作用類似，自噬的誘導并不總是起到抑制NLRP3 激活的作用。例如，在饑餓條件下誘導酵母細胞自噬能夠促進NLRP3 炎癥小體的激活[38]。但這一現(xiàn)象尚未在哺乳動物細胞中得到進一步驗證，因此尚不清楚自噬對于NLRP3炎癥小體的促進作用是否也存在于哺乳動物細胞中。

2 炎癥小體在卵巢生理和疾病中的作用

NLRP3炎癥小體在人類和嚙齒類動物的多種細胞內表達。然而，其在卵巢生理和病理中的作用卻長期未被揭示。近兩年的研究初步揭示了NLRP3在哺乳動物卵巢生理及病理中的作用。這些研究結果表明NLRP3炎癥小體不僅在卵巢功能退化以及多囊卵巢綜合征的病理進展中起到重要作用，還參與了正常的卵泡發(fā)育過程[7]。NLRP3 炎癥小體在卵巢生理、病理中作用的揭示為相關卵巢疾病的治療提供了新的研究方向。

2.1 炎癥小體在卵泡發(fā)育中的作用

在哺乳動物中，卵泡發(fā)育成熟后會進行排卵過程，將卵母細胞排入輸卵管從而進行后續(xù)的受精準備過程。卵泡作為空腔結構并不存在血管的侵入，然而其外圍的卵泡壁卻存在大量的血管網絡[39]。排卵后這些外圍血管的侵入是促進顆粒細胞（granulosa cells，GCs）分化以及黃體結構形成的重要前提[40]。有趣的是，哺乳動物的排卵過程往往也伴隨著炎癥反應的發(fā)生。在卵泡發(fā)育過程中IL-18及其受體IL-18R的表達對于促進卵泡發(fā)育起到積極的作用，而IL-1β也是促進排卵和卵母細胞成熟的重要因素[41]。過往的觀點認為，外圍血管內巨噬細胞等促炎細胞的侵入是導致這一現(xiàn)象的重要原因[42]。近期針對大鼠排卵過程的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體的激活可能也參與了排卵過程的炎癥誘導。NL?RP3在大鼠卵泡內的表達水平隨著卵泡發(fā)育的進行逐漸升高。同時，NLRP3炎癥小體的銜接蛋白ASC以及效應蛋白caspase-1 也都表現(xiàn)出與NLRP3 一致的表達趨勢，提示在卵泡的發(fā)育過程中可能就伴隨著NLRP3炎癥小體的激活[7]。同時，卵巢內IL-1β水平在卵泡發(fā)育階段始終處于較低水平而在PMSG 處理52h 后顯著升高，進一步提示了NLRP3炎癥小體與排卵炎癥之間的關聯(lián)性[7]。然而，這些實驗并未進行反向驗證，因而還需要相關實驗進行進一步闡明。

2.2 炎癥小體在多囊卵巢中的作用

PCOS是目前女性常見的內分泌疾病，也是引起育齡女性不孕的重要原因，主要表現(xiàn)為生理周期紊亂、雄激素水平過高、胰島素抵抗以及多毛等病理現(xiàn)象[43]。長期以來，研究人員觀察到PCOS患者通常也伴隨著慢性炎癥，并且發(fā)現(xiàn)炎癥對于PCOS的發(fā)生起到重要的促進作用。炎癥因子能夠通過促進卵泡膜細胞（theca cell）的雄激素生成進一步加劇PCOS 的發(fā)展[44]。因此，抑制炎癥的發(fā)展成為緩解PCOS的重要途徑。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體的激活是導致PCOS炎癥激活的重要原因[4]?；虮磉_分析結果顯示PCOS 患者的Nlrp3、Aim2、IL-18以及Asc的基因表達水平顯著升高，而Nl?rp1、Nlrp12 以及Nlrc4 等基因的表達則沒有發(fā)生顯著變化。Rostamtabar 等認為NLRP3 炎癥小體以及AIM2炎癥小體是導致IL-18 激活的重要原因[4]。雖然IL-1β的表達也發(fā)生了上調但相對IL-18 并不明顯，表明IL-18可能是炎癥小體激活導致炎癥的主要炎癥因子[4]。然而，值得注意的是，該研究的樣本量相對較小，并且也缺乏驗證實驗。

近期另一項關于PCOS 的研究對NLRP3 炎癥小體導致卵巢功能異常的分子調控機制進行了進一步闡述[5]。在睪酮誘導的小鼠PCOS模型中，NLRP3的mRNA以及蛋白表達水平在卵泡顆粒細胞內的表達明顯增加，而NLRP1和NLRC4的表達水平則沒有明顯差異。這一結論與Rostamtabar等的研究結果一致，表明NLRP3炎癥小體可能在PCOS 的炎癥誘導中起到主要作用[4，5]。同時，該研究首次發(fā)現(xiàn)細胞焦亡是導致PCOS中顆粒細胞的過度丟失的一個重要因素，而NLRP3 激活導致的caspase-1 激活參與了GSDM 剪切和顆粒細胞焦亡[5]。NLRP3 抑制劑INF39 處理小鼠能夠顯著抑制PCOS 引起的細胞焦亡和炎癥等病理現(xiàn)象。同時，通過雙氫睪酮（DHT）處理構建體外PCOS模型發(fā)現(xiàn)，DHT處理后顆粒細胞的NLRP3炎癥小體相關蛋白、焦亡水平和炎癥水平均大幅增加[5]。與體內實驗一致，INF39 處理可以抑制DHT 誘導的NLRP3 激活以及細胞焦亡并且對雄激素受體（androgen receptor，AR）和Cyp19α1 的表達也起到抑制作用[5]。這些結果提示，NLRP3 誘導的炎癥是導致PCOS雄激素過度上調的重要原因。另一方面，PCOS對于卵巢的纖維化也具有促進作用，而通過抑制NL?RP3 的表達能夠顯著減緩PCOS 引起卵巢的纖維化過程[5]。體外實驗表明，NLRP3 過表達能夠顯著促進顆粒細胞中α-SMA、CTGF、β-catenin 和TGF-β的mRNA 表達，而INF39處理對于這一現(xiàn)象具有明顯的促進作用[5]。這些結果進一步支持了體內實驗的相關結論，即NL?RP3 的激活是導致卵巢纖維化的重要因素。值得注意的是，雖然雄激素處理與NLRP3過表達都能夠促進纖維化過程，但兩者所引起的基因表達存在一定的差異。

目前的結果揭示了NLRP3 炎癥小體在PCOS 中的重要作用，提示NLRP3 可能作為治療的潛在靶點?；仡櫺耘R床分析表明，吡格列酮和鹽酸二甲雙胍聯(lián)用能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活改善PCOS癥狀[45]。有趣的是，Zhang等發(fā)現(xiàn)艾灸能夠通過間接的方式抑制NL?RP3的激活從而延緩環(huán)磷酰胺誘導的卵巢早衰[46]。

2.3 炎癥小體在卵巢衰老中的作用

在女性的衰老過程中，通常還會伴隨著卵巢功能的進行性退化，從而影響女性體內的激素水平和生育能力。炎癥是影響組織功能退化和衰老的重要因素，在自然衰老進程中出現(xiàn)的炎癥標志物水平慢性升高的現(xiàn)象也被稱為炎性衰老[47]。針對卵巢衰老的研究表明敲除小鼠的腫瘤生長因子-α（tumor growth factor-α，TNF-α）[48]或IL-1α[49]都能夠延長卵巢的功能周期，提示炎癥在卵巢衰老過程中也起到了十分重要的作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，C57小鼠在飼養(yǎng)4個月后NLRP3的表達水平顯著升高，同時伴隨著caspse-1和IL-1β的激活[6]。并且，NLRP3 的表達呈現(xiàn)出與抗穆勒氏管激素（an?ti-Mullerian hormone,AMH）水平相反的趨勢，表明NL?RP3激活可能參與了卵巢功能退化。類似的，在卵巢早衰病人的卵巢顆粒細胞樣本中也發(fā)現(xiàn)了NLRP3 的mRNA表達水平增加以及caspase-1和IL-1β激活的現(xiàn)象[6]。與Nlrp3-/-小鼠相比，正常小鼠卵巢以及血清樣本中的AMH水平在兩個月后均顯著下降，并且在12個月后Nlrp3-/-小鼠依然表現(xiàn)出良好的葡萄糖耐受水平[6]。對比正常和Nlrp3-/-小鼠的受孕能力可以發(fā)現(xiàn)，正常小鼠在12個月后受孕能力明顯降低，而Nlrp3-/-小鼠則表現(xiàn)出較好的受孕能力。同樣，利用MCC950抑制NLRP3也能夠延緩小鼠卵巢的衰老過程[6]。有趣的是，雖然ASC是NLRP3炎癥小體的重要組成部分，但Asc-/-小鼠表現(xiàn)出與正常小鼠類似的衰老過程，提示NLRP3對卵巢衰老的抑制作用可能并不依賴于ASC[6]。Chei等也發(fā)現(xiàn)與6 月齡小鼠卵巢相比，12 月齡小鼠卵巢中Nlrp3、Asc、Caspase-1 以及Pro-IL-1β的基因表達均顯著升高，而高麗參能夠通過抑制這些基因的表達延緩卵巢衰老[3]。這些研究表明，NLRP3 炎癥小體的激活是促進卵巢衰老以及功能退化的重要因素，而抑制NLRP3的激活對于卵巢功能以及生育能力的維持具有重要意義，也為卵巢衰老相關藥物的開發(fā)指明了道路。

2.4 炎癥小體在其他卵巢疾病中的作用

炎癥小體的持續(xù)性激活會增加機體的癌癥風險并促進癌癥的發(fā)展。最近的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中cas?pase-1、IL-1β以及IL-18 的mRNA 以及蛋白水平均表達水平明顯上升。同時，這些蛋白的表達區(qū)域也發(fā)生明顯變化，例如在正常卵巢中caspase-1的表達局限于上皮以及上皮以下部分區(qū)域，而在卵巢癌切片中可以發(fā)現(xiàn)caspase-1 表達于整個卵巢組織[50]。類似的，IL-1β在正常卵巢中表達微弱且主要分布于表皮層，而在卵巢癌樣本中IL-1β的表達區(qū)域明顯增大。然而，在卵巢癌樣本中并未觀察到NLRP3表達水平的增加。與此不同的是，Wu 等發(fā)現(xiàn)卵巢癌樣本中NLRP3 的表達水平顯著上升，而miR-22的下調是引起NLRP3激活的重要原因，并且表明NLRP3的過表達與預后成負相關關系[51]。卵巢癌癥樣本的異質性可能是導致這一爭議性結果的主要原因，因而NLRP3在卵巢癌中的作用還有待進一步明確。

同時，NLRP3 的過度激活在一些污染物引起的卵巢損傷中也起到重要作用。例如，卵泡中的聚苯乙烯塑料微粒能夠通過激活NLRP3/Caspase1 通路促進大鼠卵巢顆粒細胞的焦亡和凋亡過程從而引發(fā)卵巢功能的紊亂[52]。

3 小結與展望

炎癥反應的持續(xù)性激活是引起細胞和組織病變的一個重要因素。在卵巢中，炎癥伴隨著正常卵泡的發(fā)育過程，然而其過度上調也是促進卵泡發(fā)育異常和激素調控紊亂的重要因素。目前，卵巢內炎癥的形成機制還遠未闡明。近期的研究表明NLRP3炎癥小體激活參與了卵巢炎癥的調控過程，并初步揭示了NLRP3炎癥小體在卵巢功能調控中的作用機制。這些發(fā)現(xiàn)為未來卵巢相關疾病的治療提供了新的理論基礎。然而，相關研究報道仍然十分匱乏，多數研究均為首次發(fā)現(xiàn)，且研究數據并不完善，尚未形成較為穩(wěn)定的理論共識。因此，對于NLRP3 炎癥小體在卵巢中的病理性作用還有待進一步闡明。

（利益沖突：無）