鈣激活中性蛋白酶1與口腔鱗狀細胞癌遷移及侵襲的相關性

譚 丹，劉 瑤，王忠朝，胡 蕓，胡妙齡，張夢雪，毛婭林，聶敏海

西南醫(yī)科大學1.口腔頜面修復重建與再生實驗室（瀘州 646000）；2.附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜病科（瀘州 646000）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OS?CC）是口腔最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計約占口腔腫瘤的90%。腫瘤轉移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，因此對OSCC轉移機制的研究，進而阻斷其轉移，對提高患者預后具有重要的意義[1]。

鈣中性蛋白酶（calpain，CAPN）是一類特異性依靠鈣激活的中性半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布于哺乳動物細胞中，被一定濃度的鈣離子激活后發(fā)生自溶表現(xiàn)出蛋白水解酶活性[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CAPN 至少有14 種亞型，根據(jù)其分布特點分為有組織特異性中性鈣蛋白酶和無組織特異性中性鈣蛋白酶兩大類，目前人們研究比較深入的是非組織特異性的同工酶CAPN-Ⅰ與CAPN-Ⅱ，目前CAPN 許多亞型的生理功能及調(diào)控蛋白水解的機制尚未完全明確[3-6]。CAPN在病理過程中的研究一直以來主要集中于炎癥，神經(jīng)退行性病變等，近年來在腫瘤中的作用逐漸被人們所重視，越來越多的研究表明CAPN 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且具有腫瘤特異性[7-9]。

CAPN與口腔鱗狀細胞癌的關系少有報道，本研究主要從細胞和分子水平探討CAPN1 對口腔鱗癌細胞黏附、侵襲轉移等生物學行為的影響，從而探索CAPN1與口腔鱗癌預后的關系，并為CAPN1作為口腔鱗癌的治療新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

于2017年6月至2018年6月在西南醫(yī)科大學口頜面修復重建與再生實驗室完成實驗。選取人類永生化口腔角化上皮細胞系HOK作為對照組（正常組），口腔鱗癌細胞系HSC3、CAL27 作為實驗組（腫瘤組），均由實驗室保種。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：①Western blot 相關試劑：SDS-PAGE試劑、勻漿緩沖液；固相載體：PVDF尼龍膜或NC膜（硝酸纖維素薄膜）、轉膜緩沖液；膜染色液：考馬斯亮藍0.2 g；甲醇80 mL；乙酸2 mL；ddH2O 118 mL。封閉液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 mL 的0.01 mol/L PBS 中。顯色液：化學發(fā)光劑（ECL）或DAB 6.0 mg，0.01 mol/L PBS 10.0 mL，硫酸鎳胺0.1 mL；H2O21.0 mL。②RNA 干擾相關試劑：siRNA 干擾位點序列轉染使用Invitrogene 公司生產(chǎn)的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000。主要儀器：電泳儀、搖床、Transwell小室等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將細胞放入10 % 的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，添加青霉素，放入37 ℃孵箱中。當細胞長至瓶底70%左右時，用胰消化酶消化細胞，離心，棄上清液，收集細胞，清洗，重懸，傳代細胞。細胞長至80%左右，分組，細胞轉染，提取RNA或蛋白質(zhì)。

1.3.2 RNA 干擾阻滯CAPN1 以OSCC 細胞株HSC3、CAL27為研究對象，將這兩組細胞隨機分為siRNA1-1組、siRNA1-2 組、siRNA-neg 組。siRNA1-1 組：在HSC3、CAL27中分別轉染化學合成的針對CAPN1-1設計的小分子干擾RNA，沉默CAPN1-1 基因；siRNA1-2組：在HSC3、CAL27 中分別轉染化學合成的針對CAPN1-2 設計的小分子干擾RNA，沉默CAPN1-2 基因：；siRNA-neg組：采用一對經(jīng)驗證對任何人、小鼠基因序列均無特異性干擾作用的siRNA（si NC）為陰性對照。應用PCR 法和Western blot 檢測轉染后細胞內(nèi)CAPN亞型CAPN1的mRNA和蛋白水平的變化。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法 收集培養(yǎng)的細胞，加蛋白裂解液，離心，取上層液體，SDS-PAGE 電泳，轉膜，脫脂奶粉密封1 h，試劑盒測濃度，加一抗，培育24 h后緩沖液洗滌，加二抗，避光培育1 h，顯影。

1.3.4 QT-PCR 在腫瘤細胞培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，加異丙醇，離心，加75 %乙醇離心，干燥，-80 ℃保存。重復40 次反轉錄體系（94 ℃15 min，94 ℃15 s，60 ℃34 s，72 ℃10 min），計算。

1.3.5 細胞體外侵襲能力及遷移能力測定 細胞侵襲重建基底膜實驗在Transwell 小室中進行。Transwell 小室分為上下兩層，中間以聚碳酸濾膜（8 μm 孔徑）隔開，濾膜上鋪以ECMgel，實驗組和對照組的HSC3 和CAL27 細胞轉染48 h 后用胰酶消化，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。將Transwell 小室的上室浸泡于下室培養(yǎng)液中，上室加入200 μL 細胞懸液（2×105個），細胞在上層常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室，吸去Transwell上下室中的培養(yǎng)液，用無菌棉簽快速擦去Transwell上室的ECMgel和未侵襲的細胞，再用DMEM 培養(yǎng)基浸濕的棉簽重復擦Transwell 上室2～3 次，將Transwell 下表面浸泡于70%甲醇中固定30 min，再用蘇木素-伊紅浸染位于Transwell 下表面的細胞，梯度酒精脫水，二甲苯透明，在200 × 光鏡下計數(shù)位于Transwell 下表面的細胞，計數(shù)中間和四周5 個視野，實驗重復3 次，取其中平均值代表侵襲力的值。根據(jù)穿膜的數(shù)值做侵襲條形圖。細胞體外遷移能力測定該實驗與侵襲的差異在于在濾膜上未鋪以ECMgel，其余相同。計數(shù)中間和四周5 個視野，實驗重復3次，取其平均值代表遷移能力的值。根據(jù)穿膜的數(shù)值制作條形圖。

1.4 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各實驗組和對照組間均數(shù)的兩兩比較采用Dunnett-t法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CAPN1在正常細胞及口腔鱗癌細胞中的表達

Western blot 結果顯示，CAPN1 在OSCC 腫瘤組（HSC3、CAL27組）中的表達高于正常組（HOK組），P ＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 RNA干擾抑制口腔鱗癌細胞CAPN1的表達

QT-PCR 檢測顯示：siRNA1-1、siRNA1-2、及siR?NA-neg組中三組皆見actin內(nèi)參明顯均一的表達；三組皆見CAPN1 mRNA 的表達，與siRNA-neg 組相比，siR?NA1-1 組及siRNA1-2 組組中CAPN1 mRNA 的表達均明顯受到抑制（P ＜0.05），分別抑制了90%、93%。該結果提示siRNA CAPN1-1、siRNA CAPN1-2 轉染能特異地抑制CAPN1 mRNA表達，見圖1。

圖1 QT-PCR檢測轉染細胞中CAPN1蛋白表達水平的改變Figure 1 changes of CAPN1 in transfected cells detected by RT-PCR

2.3 Western blot 檢測轉染細胞中CAPN1 蛋白表達水平的改變

Western blot檢測結果顯示：CAPN1干擾后體外培養(yǎng)的HSC3 和CAL27 細胞中CAPN1 蛋白的表達變化。結果提示轉染48 h 后，在HSC3 和CAL27 細胞中，與siRNA-neg 組相比 siRNA CAPN1-1 組、siRNA CAPN1-2 組的CAPN1 蛋白的表達受到明顯抑制（P ＜0.05），這與mRNA水平的變化基本一致，見圖2。

圖2 Western blot檢測轉染細胞中CAPN1蛋白表達水平Figure 2 Western blot was used to detect the expression level of CAPN1 in transfected cells

2.4 小分子干擾RNA轉染前后細胞侵襲能力的影響

3 組細胞的侵襲能力，通過計數(shù)在趨化誘導48 h后，穿過濾膜的細胞數(shù)目來檢測的。顯微鏡下顯示siR?NA1-2 組穿膜數(shù)目最少，siRNA-neg 組數(shù)目最多。siR?NA1-1 組、siRNA1-2 組較siRNA-neg 組數(shù)目均減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），見圖3。

圖3 Transwell小室實驗測試腫瘤細胞侵襲能力Figure 3 Transwell chamber experiment tested the ability of tumor cells to invade

根據(jù)上圖穿膜細胞數(shù)目做條形圖。條形圖示：siR?NA1-1 組、siRNA1-2 組相比于siRNA-neg 組數(shù)目均有減少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），見圖4。

圖4 轉染后細胞侵襲數(shù)條形圖Figure 4 Percentage of cell migration after transfection

2.5 小分子干擾RNA轉染前后細胞遷移能力的影響

同理，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，三組細胞穿過濾膜的數(shù)目變化趨勢作圖，如下圖5?？梢钥吹?，48 h后三組細胞數(shù)目不同，并且siRNA1-2 組數(shù)目最少，siRNA-neg 組數(shù)目最多。經(jīng)統(tǒng)計學處理，siRNA1-1組與siRNA1-2組相比于siRNA-neg 組數(shù)目均有減少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。根據(jù)上圖做遷移條形圖，如下圖6。

圖5 Transwell小室實驗測試腫瘤細胞遷移能力Figure 5 Transwell chamber experiment tested the migration ability of tumor cells

圖6 轉染后細胞遷移數(shù)條形圖Figure 6 Percentage of cell migration after transfection

條形圖示：siRNA1-1 組、siRNA1-2 組相比于siR?NA-neg組數(shù)目均有減少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

3 討論

中性鈣蛋白酶系統(tǒng)在人和動物的體內(nèi)廣泛存在，是一個高度復雜，高度調(diào)控的體系。中性鈣蛋白酶系統(tǒng)不僅包括CAPN 和鈣中性蛋白酶抑制蛋白（cal?pastatin），而且還包括鈣中性蛋白酶激活蛋白（CAPN activator）。三者之間構成一個高度可調(diào)的依賴于鈣離子的蛋白水解酶系統(tǒng)。其中中性鈣蛋白酶（CAPN）是其系統(tǒng)中最核心的成分[10-12]。CAPN 在病理過程中的研究一直以來主要集中于炎癥，神經(jīng)退行性病變等，近年來在腫瘤中的作用逐漸被人們所重視，越來越多的研究表明CAPN 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時研究也表明CAPN在多種腫瘤中起到的作用不盡相同[13-14]，最新研究顯示，在許多腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在CAPN的異常表達[2-3，10]，但目前國內(nèi)外關于CAPN家族與口腔鱗狀細胞癌的相關性研究較少，本研究首次聚焦于CAPN 家族與口腔鱗狀細胞癌的相關性。

CAPN系統(tǒng)在腫瘤生物學中發(fā)揮了重要的作用，大量研究表明其在細胞保護、凋亡、自噬通路中的作用較為明確，而在細胞骨架重建、細胞遷移、侵襲方面的研究有限[1，4，13，21]，亟待系統(tǒng)建立CAPN 在腫瘤細胞遷移、侵襲及細胞骨架重建方面的作用，本研究也首次嘗試探索CAPN1 在口腔鱗狀細胞癌細胞遷移、侵襲的關系，為口腔癌患者提供靶向治療的理論依據(jù)。

本研究在細胞及蛋白水平初探索了CAPN與口腔鱗狀細胞癌的遷移、侵襲的相關性，研究結果表明CAPN1 在鱗狀細胞中高表達，并且可升高口腔鱗癌細胞遷移、侵襲能力，可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，這些結果可能為口腔鱗狀細胞癌靶向治療提供了新的視角。

CAPN通過什么通路，具體如何影響腫瘤細胞的侵襲及遷移目前仍然存在多種說法，這些說法目前其實主要傾向于CAPN水解多種調(diào)節(jié)細胞黏附及肌球蛋白力學相關的底物發(fā)揮作用[15-21]，這些研究的背景也為我們下一步探索提供系新的方向。

4 結論

本研究主要通過生物學的實驗方法探討CAPN1對口腔鱗癌細胞侵襲轉移等生物學行為的影響，從而初步探討CAPN1與口腔鱗癌的關系。本研究結果發(fā)現(xiàn)相較于正常細胞，口腔鱗狀細胞癌中存在CAPN1表達上調(diào)，同時通過RNA 干擾技術將CAPN1 沉默后對OS?CC 細胞學行為的作用進行了初步探索，研究表明CAPN1 基因沉默引起OSCC 細胞侵襲和黏附能力下降，此結果提示CAPN1可能與腫瘤轉移或不良預后密切相關。

（利益沖突：無）