SDS-PAGE法對(duì)乳及乳制品中主要蛋白的定性和定量分析

劉利娟

嬰幼兒配方奶粉是以母乳為標(biāo)準(zhǔn)，選自優(yōu)質(zhì)乳牛的奶源，對(duì)牛奶的主要蛋白質(zhì)成分調(diào)整，使其最大限度地接近母乳，從而更適合嬰兒的腸胃吸收和營(yíng)養(yǎng)需求。牛乳中的蛋白質(zhì)主要分為酪蛋白和乳清蛋白兩個(gè)重要組成部分，其中酪蛋白占乳總蛋白含量約80%，酪蛋白主要包含αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和?-酪蛋白四種蛋白質(zhì)，分別占總酪蛋白的比例為4：1：4：1，乳清蛋白占乳總蛋白含量約20%，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白（Q-LA）、β-乳球蛋白（B-LG）、免疫球蛋白（Ig）和牛血清蛋白（BSA）組成，分別占總?cè)榍宓鞍椎?：2：8：5。其中，α-乳白蛋白含有豐富的色氨酸，能夠促進(jìn)嬰兒的神經(jīng)發(fā)育，易被腸道消化吸收，且不易引起嬰兒過(guò)敏。為了使嬰兒配方奶粉的營(yíng)養(yǎng)成分更接近母乳，通常會(huì)特別添加α-乳白蛋白，且通過(guò)調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的比例，為嬰兒提供更健康營(yíng)養(yǎng)的食品。

目前對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的方法較多，包括凱氏定氮法、SDS-PAGE電泳法、雙縮脲法、分光光度法、高效液相色譜法等。凱氏定氮法主要用于乳品中總蛋白的含量測(cè)定，其他方法不能夠?qū)崿F(xiàn)不同種類蛋白質(zhì)的有效分離，高效液相色譜雖然檢測(cè)精確度較高，但存在檢測(cè)成本高、樣品前處理麻煩、不能同時(shí)測(cè)定多種蛋白質(zhì)含量等缺點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)方法優(yōu)化，獲得操作簡(jiǎn)單、成本低，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)測(cè)定多種乳及乳制品中主要蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，為調(diào)整嬰幼兒配方奶粉中主要酪蛋白和乳清蛋白的比例提供技術(shù)參考。

1. 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

凝膠電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司）;凝膠成像分析儀（美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司）;雙垂直電泳槽（美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司）;MO10型定軌搖床（德國(guó)LABSTAR的公司）。

1.2 材料與試劑

α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司，純度≥70%）;β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司，純度≥98%）;κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司，純度≥70%）;α-乳白蛋白（sigma公司，純度≥85%）;β-乳球蛋白（sigma公司，純度≥90%）;標(biāo)準(zhǔn)電泳蛋白Maker（sigma公司，6.5-200ku）;鮮牛乳;嬰幼兒配方奶粉。

電泳儲(chǔ)備液：30%丙烯酰胺單體儲(chǔ)備液、分離膠緩沖液（1.5M Tris-HCl pH 8.8）、濃縮膠緩沖溶液（0.5M Tris-HCl pH 6.8）、10%SDS 、雙蒸水、10%過(guò)硫酸、TEMED（四甲基乙二胺）。

樣品緩沖液：取濃縮膠緩沖液12.5mL、SDS 2g、β-巰基乙醇15mL、甘油10mL和溴酚藍(lán)0.2g，用雙蒸水定容至100mL，-20℃保存。

電極緩沖液（pH8.3）：將1.0gSDS、3.0gTris 和14.4g甘氨酸溶于900mL 去離子水，用去離子水定容至1000mL。

染色液：取10mL 冰乙酸、45mL 乙醇和0.2g 考馬斯亮藍(lán)R-250，用去離子水定容至100mL;脫色液：取100mL冰醋酸和200mL乙醇，用去離子水定容至1000mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理

量取10mL鮮牛乳樣品，樣品在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，去除脂肪層，留取清液備用，清液、水、樣品緩沖液以1：1：2的混合，沸水浴加熱10min，10000r/min離心10min，取清液分裝，備用。

稱取1g嬰幼兒配方奶粉樣品，用雙蒸水定容至10mL，10000r/min，轉(zhuǎn)速下離心15min，步驟同鮮牛乳樣品。

1.3.2 電泳條件

配制15%分離膠：30%丙烯酰單體胺儲(chǔ)備6mL，分離膠緩沖液3mL，10%SDS120μL，雙蒸水3mL，10%過(guò)硫酸銨60μL，TEMED 6μL。

配制4%濃縮膠：30%丙烯酰單體胺儲(chǔ)備0.67mL，濃縮膠緩沖液1mL，10%SDS40μL，雙蒸水3.33mL，10%過(guò)硫酸銨30μL，TEMED 10μL。

將制備好的膠放入電泳槽內(nèi)，加入電極緩沖液，將梳子垂直緩慢地拔出，分別對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不同濃度、不同體積進(jìn)樣。預(yù)電泳電壓80V，分離膠與濃縮膠分界處改為130V電壓完成電泳。0.1%考馬斯亮藍(lán)溶液染色1h，脫色液洗脫過(guò)夜，至凝膠背景為透明無(wú)色。

2. 結(jié)果與分析

2.1 分離膠濃度的選擇

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)，即只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于樣品可以在進(jìn)入分離膠之前在濃縮膠上達(dá)到相同的速度，即使樣品達(dá)到相同的初速度和初始值。帶電膠粒在電場(chǎng)作用下向著與自身相反的電荷方向移動(dòng)，且分子量越小的粒子，受到的阻力越小，分子遷移的速度越快，分子量越大的粒子收到的阻力越大，遷移速度越慢，這樣蛋白質(zhì)通過(guò)電泳因分子量的不同得到分離。將樣品稀釋相同的倍數(shù)、相同的電泳條件、不同的分離膠濃度，即分別為5%、10%、15%、25%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，5%的分離膠的阻礙作用較弱，圖像比較模糊，顏色較淺;12%和20%的分離膠具有較小的孔徑，較能起到分子篩的作用，圖像顏色較深、清晰度較好，15%的分離膠濃度條帶最清晰，各蛋白的遷移距離較短，電泳的時(shí)間較適中。

2.2 樣品前處理的選擇

處理一：液體樣品、水、樣品緩沖液混合比例為1：1：2，沸水浴5min，離心5min，去除脂肪，取上清液分裝，在-20℃保存，備用。稱取固體樣品1.0000g，加水定容至10mL，同上液體樣品處理方法。該前處理方法跑出了7條蛋白條帶，但β-酪蛋白和κ-酪蛋白沒(méi)有得到很好的分離。

處理二：取1mL的鮮牛乳、酸奶，0.1g/mL嬰幼兒奶粉復(fù)原乳于離心管內(nèi)，用尿素稀釋8倍，分別取樣品80μL加入20μL上樣緩沖液，搖勻，沸水浴10min，離心10000r/min，5min。該前處理方法出現(xiàn)5條蛋白條帶，其中κ-酪蛋白、α-乳白蛋白均未出現(xiàn)，因此該前處理方法分離效果不好。

處理三：前處理方法同上述1.3.1，此前處理方法出現(xiàn)9條蛋白條帶，其中主要的五種蛋白均清晰呈現(xiàn)，即α-酪蛋白（其中包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白）、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白，處理方法最佳。

2.3 上樣量的確定

按照1.3.1樣品的前處理方法對(duì)方法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，將樣品稀釋成8倍的濃度，分別對(duì)樣品上樣12μL 、10μL、8μL、5μL對(duì)電泳圖譜進(jìn)行光密度掃描，結(jié)果顯示上樣量為12μL時(shí)圖中跑出7種蛋白，但峰展寬較寬，尤其第7條帶出現(xiàn)平頭峰，故樣品進(jìn)樣量太大;上樣量為8μL和5μL時(shí)，乳清蛋白沒(méi)有測(cè)出，說(shuō)明樣品濃度太小，乳清蛋白不易被檢出，上樣量為10μL時(shí)，電泳圖譜共跑出9條帶，分離度非常好，故確定最佳上樣量為10μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍的確定

按照1.3.1的前處理方法處理標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)樣10μL、9μL、8μL、7μL、6μL、5μL、4μL、3μL、2μL，通過(guò)凝膠成像分析儀分析圖像，利用AlphaView-AlphaImager HP軟件計(jì)算出灰度值，通過(guò)灰度值和進(jìn)樣量的關(guān)系，以上樣量為橫坐標(biāo)，灰度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=365.48x+415.26，線性范圍1.1-5μg，相關(guān)系數(shù)0.9957;β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=219.64x+112.93，線性范圍1.1-5μg，相關(guān)系數(shù)0.9921;α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=584.38x+343.06，線性范圍1.1-5μg，相關(guān)系數(shù)0.9907;β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方y(tǒng)=781.19x+168.41，線性范圍0.5-1.5μg，相關(guān)系數(shù)0.9954;牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=922.61x+103.13，線性范圍0.4-1.6μg，相關(guān)系數(shù)0.9957。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

在同一塊膠上每種樣品進(jìn)樣10μL，平行上樣3次，按照1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行電泳，結(jié)束后通過(guò)凝膠成像儀對(duì)凝膠板進(jìn)行分析，計(jì)算得灰度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中蛋白的含量，結(jié)果如下表1所示。

由表1可知，奶粉中α-乳白蛋白的含量比牛乳中的高，是由于為了幫助寶寶對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收，嬰幼兒配方奶粉中添加了α-乳清蛋白的緣故，而奶粉樣品的其他各蛋白組分的含量比牛乳的偏低，可能是由于奶粉處理過(guò)程中會(huì)有部分損失，或者奶粉中添加了其他的營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致蛋白含量相對(duì)較低。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

分別將鮮牛乳和嬰幼兒配方奶粉樣品平均分成三份，分別加入三個(gè)質(zhì)量梯度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算出方法的加標(biāo)回收率。如下表2所示。

由表2可知，鮮牛奶和嬰幼兒配方奶粉中五種蛋白的加標(biāo)回收率在87.54%-104.68%之間，RSD值在0.79%-4.49%之間，方法回收率良好。

3. 結(jié)果與討論

本研究建立了SDS-PAGE法對(duì)鮮牛乳、嬰幼兒配方奶粉內(nèi)主要蛋白質(zhì)成分的定性和定量分析。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了α-酪蛋白、β-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和牛血清蛋白的分離，并對(duì)五種蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析。五種蛋白質(zhì)測(cè)定的R2值均大于0.99，線性關(guān)系良好，精密度實(shí)驗(yàn)中RSD范圍在0.34%-4.38%之間，實(shí)驗(yàn)精確度良好，加標(biāo)回收率范圍為87.54%-104.68%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的實(shí)驗(yàn)條件，可以對(duì)乳及乳制品中的主要蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，并能夠?qū)崿F(xiàn)操作簡(jiǎn)便、成本低、同時(shí)測(cè)定乳及乳制品中多種蛋白質(zhì)，能夠?yàn)檎{(diào)整嬰兒配方奶粉中的蛋白質(zhì)比例提供有力的技術(shù)支持。