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    SDS-PAGE法對(duì)乳及乳制品中主要蛋白的定性和定量分析

    2022-03-30 02:30:08劉利娟
    食品界 2022年3期
    關(guān)鍵詞:牛乳酪蛋白乳清

    劉利娟

    嬰幼兒配方奶粉是以母乳為標(biāo)準(zhǔn),選自優(yōu)質(zhì)乳牛的奶源,對(duì)牛奶的主要蛋白質(zhì)成分調(diào)整,使其最大限度地接近母乳,從而更適合嬰兒的腸胃吸收和營(yíng)養(yǎng)需求。牛乳中的蛋白質(zhì)主要分為酪蛋白和乳清蛋白兩個(gè)重要組成部分,其中酪蛋白占乳總蛋白含量約80%,酪蛋白主要包含αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和?-酪蛋白四種蛋白質(zhì),分別占總酪蛋白的比例為4:1:4:1,乳清蛋白占乳總蛋白含量約20%,乳清蛋白主要由α-乳白蛋白(Q-LA)、β-乳球蛋白(B-LG)、免疫球蛋白(Ig)和牛血清蛋白(BSA)組成,分別占總?cè)榍宓鞍椎?:2:8:5。其中,α-乳白蛋白含有豐富的色氨酸,能夠促進(jìn)嬰兒的神經(jīng)發(fā)育,易被腸道消化吸收,且不易引起嬰兒過(guò)敏。為了使嬰兒配方奶粉的營(yíng)養(yǎng)成分更接近母乳,通常會(huì)特別添加α-乳白蛋白,且通過(guò)調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的比例,為嬰兒提供更健康營(yíng)養(yǎng)的食品。

    目前對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的方法較多,包括凱氏定氮法、SDS-PAGE電泳法、雙縮脲法、分光光度法、高效液相色譜法等。凱氏定氮法主要用于乳品中總蛋白的含量測(cè)定,其他方法不能夠?qū)崿F(xiàn)不同種類蛋白質(zhì)的有效分離,高效液相色譜雖然檢測(cè)精確度較高,但存在檢測(cè)成本高、樣品前處理麻煩、不能同時(shí)測(cè)定多種蛋白質(zhì)含量等缺點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)方法優(yōu)化,獲得操作簡(jiǎn)單、成本低,能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)測(cè)定多種乳及乳制品中主要蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法,為調(diào)整嬰幼兒配方奶粉中主要酪蛋白和乳清蛋白的比例提供技術(shù)參考。

    1. 材料與方法

    1.1 儀器與設(shè)備

    凝膠電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司);凝膠成像分析儀(美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司);雙垂直電泳槽(美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司);MO10型定軌搖床(德國(guó)LABSTAR的公司)。

    1.2 材料與試劑

    α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司,純度≥70%);β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司,純度≥98%);κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司,純度≥70%);α-乳白蛋白(sigma公司,純度≥85%);β-乳球蛋白(sigma公司,純度≥90%);標(biāo)準(zhǔn)電泳蛋白Maker(sigma公司,6.5-200ku);鮮牛乳;嬰幼兒配方奶粉。

    電泳儲(chǔ)備液:30%丙烯酰胺單體儲(chǔ)備液、分離膠緩沖液(1.5M Tris-HCl pH 8.8)、濃縮膠緩沖溶液(0.5M Tris-HCl pH 6.8)、10%SDS 、雙蒸水、10%過(guò)硫酸、TEMED(四甲基乙二胺)。

    樣品緩沖液:取濃縮膠緩沖液12.5mL、SDS 2g、β-巰基乙醇15mL、甘油10mL和溴酚藍(lán)0.2g,用雙蒸水定容至100mL,-20℃保存。

    電極緩沖液(pH8.3):將1.0gSDS、3.0gTris 和14.4g甘氨酸溶于900mL 去離子水,用去離子水定容至1000mL。

    染色液:取10mL 冰乙酸、45mL 乙醇和0.2g 考馬斯亮藍(lán)R-250,用去離子水定容至100mL;脫色液:取100mL冰醋酸和200mL乙醇,用去離子水定容至1000mL。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 樣品的前處理

    量取10mL鮮牛乳樣品,樣品在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,去除脂肪層,留取清液備用,清液、水、樣品緩沖液以1:1:2的混合,沸水浴加熱10min,10000r/min離心10min,取清液分裝,備用。

    稱取1g嬰幼兒配方奶粉樣品,用雙蒸水定容至10mL,10000r/min,轉(zhuǎn)速下離心15min,步驟同鮮牛乳樣品。

    1.3.2 電泳條件

    配制15%分離膠:30%丙烯酰單體胺儲(chǔ)備6mL,分離膠緩沖液3mL,10%SDS120μL,雙蒸水3mL,10%過(guò)硫酸銨60μL,TEMED 6μL。

    配制4%濃縮膠:30%丙烯酰單體胺儲(chǔ)備0.67mL,濃縮膠緩沖液1mL,10%SDS40μL,雙蒸水3.33mL,10%過(guò)硫酸銨30μL,TEMED 10μL。

    將制備好的膠放入電泳槽內(nèi),加入電極緩沖液,將梳子垂直緩慢地拔出,分別對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不同濃度、不同體積進(jìn)樣。預(yù)電泳電壓80V,分離膠與濃縮膠分界處改為130V電壓完成電泳。0.1%考馬斯亮藍(lán)溶液染色1h,脫色液洗脫過(guò)夜,至凝膠背景為透明無(wú)色。

    2. 結(jié)果與分析

    2.1 分離膠濃度的選擇

    SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng),即只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于樣品可以在進(jìn)入分離膠之前在濃縮膠上達(dá)到相同的速度,即使樣品達(dá)到相同的初速度和初始值。帶電膠粒在電場(chǎng)作用下向著與自身相反的電荷方向移動(dòng),且分子量越小的粒子,受到的阻力越小,分子遷移的速度越快,分子量越大的粒子收到的阻力越大,遷移速度越慢,這樣蛋白質(zhì)通過(guò)電泳因分子量的不同得到分離。將樣品稀釋相同的倍數(shù)、相同的電泳條件、不同的分離膠濃度,即分別為5%、10%、15%、25%進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,5%的分離膠的阻礙作用較弱,圖像比較模糊,顏色較淺;12%和20%的分離膠具有較小的孔徑,較能起到分子篩的作用,圖像顏色較深、清晰度較好,15%的分離膠濃度條帶最清晰,各蛋白的遷移距離較短,電泳的時(shí)間較適中。

    2.2 樣品前處理的選擇

    處理一:液體樣品、水、樣品緩沖液混合比例為1:1:2,沸水浴5min,離心5min,去除脂肪,取上清液分裝,在-20℃保存,備用。稱取固體樣品1.0000g,加水定容至10mL,同上液體樣品處理方法。該前處理方法跑出了7條蛋白條帶,但β-酪蛋白和κ-酪蛋白沒(méi)有得到很好的分離。

    處理二:取1mL的鮮牛乳、酸奶,0.1g/mL嬰幼兒奶粉復(fù)原乳于離心管內(nèi),用尿素稀釋8倍,分別取樣品80μL加入20μL上樣緩沖液,搖勻,沸水浴10min,離心10000r/min,5min。該前處理方法出現(xiàn)5條蛋白條帶,其中κ-酪蛋白、α-乳白蛋白均未出現(xiàn),因此該前處理方法分離效果不好。

    處理三:前處理方法同上述1.3.1,此前處理方法出現(xiàn)9條蛋白條帶,其中主要的五種蛋白均清晰呈現(xiàn),即α-酪蛋白(其中包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白)、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白,處理方法最佳。

    2.3 上樣量的確定

    按照1.3.1樣品的前處理方法對(duì)方法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,將樣品稀釋成8倍的濃度,分別對(duì)樣品上樣12μL 、10μL、8μL、5μL對(duì)電泳圖譜進(jìn)行光密度掃描,結(jié)果顯示上樣量為12μL時(shí)圖中跑出7種蛋白,但峰展寬較寬,尤其第7條帶出現(xiàn)平頭峰,故樣品進(jìn)樣量太大;上樣量為8μL和5μL時(shí),乳清蛋白沒(méi)有測(cè)出,說(shuō)明樣品濃度太小,乳清蛋白不易被檢出,上樣量為10μL時(shí),電泳圖譜共跑出9條帶,分離度非常好,故確定最佳上樣量為10μL。

    2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍的確定

    按照1.3.1的前處理方法處理標(biāo)準(zhǔn)品,分別進(jìn)樣10μL、9μL、8μL、7μL、6μL、5μL、4μL、3μL、2μL,通過(guò)凝膠成像分析儀分析圖像,利用AlphaView-AlphaImager HP軟件計(jì)算出灰度值,通過(guò)灰度值和進(jìn)樣量的關(guān)系,以上樣量為橫坐標(biāo),灰度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=365.48x+415.26,線性范圍1.1-5μg,相關(guān)系數(shù)0.9957;β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=219.64x+112.93,線性范圍1.1-5μg,相關(guān)系數(shù)0.9921;α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=584.38x+343.06,線性范圍1.1-5μg,相關(guān)系數(shù)0.9907;β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方y(tǒng)=781.19x+168.41,線性范圍0.5-1.5μg,相關(guān)系數(shù)0.9954;牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程y=922.61x+103.13,線性范圍0.4-1.6μg,相關(guān)系數(shù)0.9957。

    2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

    在同一塊膠上每種樣品進(jìn)樣10μL,平行上樣3次,按照1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行電泳,結(jié)束后通過(guò)凝膠成像儀對(duì)凝膠板進(jìn)行分析,計(jì)算得灰度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得樣品中蛋白的含量,結(jié)果如下表1所示。

    由表1可知,奶粉中α-乳白蛋白的含量比牛乳中的高,是由于為了幫助寶寶對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收,嬰幼兒配方奶粉中添加了α-乳清蛋白的緣故,而奶粉樣品的其他各蛋白組分的含量比牛乳的偏低,可能是由于奶粉處理過(guò)程中會(huì)有部分損失,或者奶粉中添加了其他的營(yíng)養(yǎng)成分,導(dǎo)致蛋白含量相對(duì)較低。

    2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

    分別將鮮牛乳和嬰幼兒配方奶粉樣品平均分成三份,分別加入三個(gè)質(zhì)量梯度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算出方法的加標(biāo)回收率。如下表2所示。

    由表2可知,鮮牛奶和嬰幼兒配方奶粉中五種蛋白的加標(biāo)回收率在87.54%-104.68%之間,RSD值在0.79%-4.49%之間,方法回收率良好。

    3. 結(jié)果與討論

    本研究建立了SDS-PAGE法對(duì)鮮牛乳、嬰幼兒配方奶粉內(nèi)主要蛋白質(zhì)成分的定性和定量分析。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件,實(shí)現(xiàn)了α-酪蛋白、β-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和牛血清蛋白的分離,并對(duì)五種蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析。五種蛋白質(zhì)測(cè)定的R2值均大于0.99,線性關(guān)系良好,精密度實(shí)驗(yàn)中RSD范圍在0.34%-4.38%之間,實(shí)驗(yàn)精確度良好,加標(biāo)回收率范圍為87.54%-104.68%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立的實(shí)驗(yàn)條件,可以對(duì)乳及乳制品中的主要蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,并能夠?qū)崿F(xiàn)操作簡(jiǎn)便、成本低、同時(shí)測(cè)定乳及乳制品中多種蛋白質(zhì),能夠?yàn)檎{(diào)整嬰兒配方奶粉中的蛋白質(zhì)比例提供有力的技術(shù)支持。

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