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    使用凍融單一病毒收獲液凍干乙腦減毒活疫苗成品質(zhì)量考察

    2022-03-29 14:05:40周衛(wèi)郭紅王玖強(qiáng)廖海棠楊文杰李俊明周超廖健劉少祥
    生物化工 2022年1期
    關(guān)鍵詞:乙腦滲透壓熱穩(wěn)定性

    周衛(wèi),郭紅,王玖強(qiáng),廖海棠,楊文杰,李俊明,周超,廖健,劉少祥

    (成都生物制品研究所有限責(zé)任公司,四川省疫苗工程技術(shù)研究中心,四川成都 610023)

    流行性乙型腦炎簡稱乙腦,又稱為日本腦炎(Japanese encephalitis,JE),是由嗜神經(jīng)性病毒乙腦病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性炎癥[1]。我國每年約6.8萬乙腦臨床病例,病死率可高達(dá)30%,另外高達(dá)50%的乙腦幸存者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1-3]。目前依然沒有治愈乙腦的特效療法[4],疫苗接種仍是預(yù)防乙腦最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段[5]。

    乙腦病毒有5種基因型,分別為G1、G2、G3、G4及G5[1]。疫苗株SA14-14-2在我國廣泛使用,并認(rèn)為對所有基因型均具有較好的保護(hù)效果[6-7]。乙型腦炎減毒活疫苗(乙腦活疫苗)是將SA14-14-2乙腦減毒株接種原代SPF地鼠腎細(xì)胞,收獲病毒液,加入適宜的保護(hù)劑,經(jīng)分裝、凍干制成[8]。

    有資料表明,乙腦活疫苗的免疫力與病毒滴度高低成正比[9]。目前,成都生物制品研究所有限責(zé)任公司(以下簡稱公司)單一病毒收獲液暫存于2~8 ℃冷庫,長期儲存病毒滴度會(huì)逐漸下降[10]。因此滴度結(jié)果出來后,需要盡快將單一病毒收獲液投入生產(chǎn)使用(單一效期不超過15 d),無法等所有檢定結(jié)果,從而導(dǎo)致中間品的風(fēng)險(xiǎn)放行。因此,研究將單一病毒收獲液-70 ℃凍存,以控制效價(jià)損失;待獲得單一病毒收獲液所有檢定結(jié)果后,再27 ℃水浴解凍;使用凍融單一病毒收獲液凍干成品,統(tǒng)計(jì)分析成品的相關(guān)質(zhì)量屬性是否會(huì)受到影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    乙腦活疫苗單一病毒收獲液,公司病毒性疫苗一室提供。

    糖溶液、明膠溶液、原倍無酚紅歐式平衡鹽溶液、HCl溶液和20%尿素溶液,公司病毒性疫苗一室提供;人血白蛋白,成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司;BHK21細(xì)胞、MEM培養(yǎng)液、甲基纖維素覆蓋物和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的結(jié)晶紫染色液,公司質(zhì)量檢定室。

    1.2 儀器與設(shè)備

    S220型pH計(jì),梅特勒-托利多公司;OM819C型冰點(diǎn)滲透壓儀,德國羅澤公司;FLC3120型分裝機(jī),德國博世公司;LYO-20型凍干機(jī),上海東富龍科技股份有限公司。

    1.3 凍干成品及樣品采集

    將單一病毒收獲液凍存于-70 ℃冰柜,至少儲存30 d后,于27 ℃水浴融解。按照公司常規(guī)生產(chǎn)方法,使用凍融單一病毒收獲液配制半成品,并分裝、凍干制得成品,1人份成品批號分別為T-A001~T-A006,5人份成品批號分別為T-C001~T-C006。所有成品進(jìn)行病毒基礎(chǔ)滴度、病毒熱穩(wěn)定性、水分、pH值及滲透壓摩爾濃度等項(xiàng)目的檢測。

    1.4 病毒基礎(chǔ)滴度檢測

    采用《中華人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定的BHK21細(xì)胞蝕斑法[11]122-126檢測病毒滴度,將待檢測液進(jìn)行10倍系列稀釋,至少取3個(gè)稀釋度的病毒液,分別接種BHK21細(xì)胞,用蝕斑法進(jìn)行滴定。

    1.5 病毒熱穩(wěn)定性檢測

    將樣品于37 ℃放置7 d后和病毒基礎(chǔ)滴度樣品一起進(jìn)行病毒滴度檢測。

    1.6 水分檢測

    采用《中華人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定的費(fèi)休氏法[11]通則65,根據(jù)碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中與水定量反應(yīng)的原理測定水分。

    1.7 pH值檢測

    采用《中華人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定的pH值測定法[11]通則35,使用酸度計(jì)進(jìn)行pH值測定,水溶液的pH通常以玻璃電極為指示電極、飽和甘汞電極和銀-氯化銀電極為參比電極進(jìn)行測定。

    1.8 滲透壓摩爾濃度檢測

    采用《中華人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定的滲透壓摩爾濃度測定法[11]通則36,通常采用測量溶液的冰點(diǎn)下降來間接測定其滲透壓摩爾濃度。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    使用SPSS 24.0軟件處理數(shù)據(jù),以常規(guī)生產(chǎn)均值為假設(shè)中位數(shù)和檢驗(yàn)值,對檢測結(jié)果進(jìn)行單樣本W(wǎng)ilcoxon符號秩檢驗(yàn)和單樣本T檢驗(yàn):P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 成品病毒基礎(chǔ)滴度、熱穩(wěn)定性檢定結(jié)果分析

    2.1.1 1 人份成品

    以公司成品滴度歷史數(shù)據(jù)均值6.89 lgPFU/mL為假設(shè)中位數(shù),對6批成品滴度進(jìn)行檢驗(yàn),P=0.463,P>0.05,表明6批成品滴度與常規(guī)生產(chǎn)成品滴度均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品熱穩(wěn)定性均值6.55 lgPFU/mL為假設(shè)中位數(shù),對6批成品熱穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn),P=0.400>0.05,表明6批成品熱穩(wěn)定性與常規(guī)生產(chǎn)成品熱穩(wěn)定性均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以公司成品滴度下降歷史數(shù)據(jù)均值0.34 lgPFU/mL為檢驗(yàn)值,對6批成品滴度下降值進(jìn)行檢驗(yàn),t=0.246,P=0.815>0.05,表明6批成品滴度下降值與常規(guī)生產(chǎn)成品滴度下降均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.1.2 5 人份成品

    以成品滴度均值6.45 lgPFU/mL為假設(shè)中位數(shù),對6批成品滴度進(jìn)行檢驗(yàn),P=0.753,P>0.05,表明6批成品滴度與常規(guī)生產(chǎn)成品滴度均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品熱穩(wěn)定性均值6.19 lgPFU/mL為假設(shè)中位數(shù),對6批成品熱穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn),P=0.916,P>0.05,表明6批成品熱穩(wěn)定性與常規(guī)生產(chǎn)成品熱穩(wěn)定性均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品滴度下降均值0.26 lgPFU/mL為檢驗(yàn)值,對6批成品滴度下降值進(jìn)行檢驗(yàn),t=0.937,P=0.392>0.05,表明6批成品滴度下降值與常規(guī)生產(chǎn)成品滴度下降均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成品病毒基礎(chǔ)滴度、熱穩(wěn)定性檢定結(jié)果見表1。對公司成品基礎(chǔ)滴度和熱穩(wěn)定性及滴度下降值歷史數(shù)據(jù),使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)可知,常規(guī)生產(chǎn)中,成品基礎(chǔ)滴度和熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,滴度下降值服從正態(tài)分布。

    表1 成品病毒滴度、熱穩(wěn)定性結(jié)果

    2.2 成品水分、pH值、滲透壓摩爾濃度檢定結(jié)果分析

    2.2.1 1 人份成品

    以公司成品水分歷史數(shù)據(jù)均值1.07%為檢驗(yàn)值,對6批成品水分進(jìn)行檢驗(yàn),t=0.462,P=0.664(P>0.05),表明6批成品水分值與常規(guī)生產(chǎn)水分均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品pH=8.29為檢驗(yàn)值,對6批成品pH值進(jìn)行檢驗(yàn),t=-1.030,P=0.350(P>0.05),表明6批成品pH值與常規(guī)生產(chǎn)pH均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品滲透壓摩爾濃度均值734 mOsm/L為檢驗(yàn)值,對6批成品滲透壓摩爾濃度進(jìn)行檢驗(yàn),t=-1.496,P=0.195(P>0.05),表明6批成品滲透壓摩爾濃度與常規(guī)生產(chǎn)滲透壓摩爾濃度均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.2.2 5 人份成品

    以公司成品水分歷史數(shù)據(jù)均值1.08%為檢驗(yàn)值,對6批成品水分進(jìn)行檢驗(yàn),t=1.599,P=0.171(P>0.05),表明6批成品水分值與常規(guī)生產(chǎn)水分均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品pH=7.96為檢驗(yàn)值,對6批成品pH值進(jìn)行檢驗(yàn),t=0.750,P=0.487(P>0.05),表明6批成品pH值與常規(guī)生產(chǎn)pH均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以成品滲透壓摩爾濃度均值470 mOsm/L為檢驗(yàn)值,對6批成品滲透壓摩爾濃度進(jìn)行檢驗(yàn),t=-0.369,P=0.727(P>0.05),表明6批成品滲透壓摩爾濃度與常規(guī)生產(chǎn)滲透壓摩爾濃度均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成品水分、pH值、滲透壓摩爾濃度檢定結(jié)果,此三項(xiàng)檢定結(jié)果服從正態(tài)分布,見表2。

    表2 成品水分、pH值、滲透壓摩爾濃度結(jié)果

    3 結(jié)論

    與公司常規(guī)生產(chǎn)工藝相比,凍融生產(chǎn)工藝的優(yōu)勢在于單一病毒收獲液凍存在-70 ℃條件下可長期儲存,等所有檢定項(xiàng)目結(jié)束后,再投入下一步使用。該工藝在顯著延長儲存時(shí)間的同時(shí),病毒效價(jià)損失也顯著減少,且無需進(jìn)行中間品的風(fēng)險(xiǎn)放行,生產(chǎn)安排更加靈活、可控,大大降低了因生產(chǎn)計(jì)劃變動(dòng)而導(dǎo)致的單一病毒收獲液廢棄的風(fēng)險(xiǎn)。凍存需使用一次性儲液袋和超低溫設(shè)備,這在存儲材料和設(shè)備方面增加了成本,但是凍存后延長的的存儲時(shí)間,可以減少浪費(fèi)以及生產(chǎn)廢棄所需要投入的人力、物力、財(cái)力成本,綜合評估,凍存的方式更有利于公司多方利益。

    本文分析數(shù)據(jù)時(shí)使用的參考數(shù)據(jù)為乙腦減毒活疫苗常規(guī)均值,雖然數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但由于試驗(yàn)數(shù)據(jù)樣本量的限制,科室若使用凍融工藝進(jìn)行生產(chǎn)后,仍需重新收集成品的質(zhì)量屬性數(shù)據(jù),并重新制定平均值、警戒限及行動(dòng)限。

    從成本和適用性出發(fā),本試驗(yàn)僅對可能受到凍融工藝影響的部分中間產(chǎn)品、成品質(zhì)量屬性進(jìn)行了考察,已考察的質(zhì)量屬性數(shù)據(jù)穩(wěn)定,表明凍融工藝未影響成品質(zhì)量。本研究為在生產(chǎn)中使用凍融單一凍干成品提供了試驗(yàn)基礎(chǔ),今后還需對成品所有質(zhì)量屬性,尤其是安全性、長期穩(wěn)定性等方面進(jìn)行考察,以確定在常規(guī)生產(chǎn)中使用凍融單一病毒收獲液凍干成品的可行性。

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