龍腦樟乙酸乙酯部位的抗炎及抗腫瘤活性研究

曹明原，吳靜，顧震，吳磊，彭建軍

（1.江西省科學院 應用化學研究所，江西南昌 330096；2.江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西南昌 330000；3.江西樟鄉(xiāng)天然冰片有限責任公司，江西吉安 343000）

龍腦樟（Cinnamomum camphora chvar. Borneol）為樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）的一種香樟樹，1987年首次發(fā)現(xiàn)于江西省吉安市，目前主要在江西、湖南兩地有所種植，資源較為稀缺[1-2]。龍腦樟因富含右旋龍腦（天然冰片），在中醫(yī)典籍中被歸于芳香開竅類藥材，民間常將其用于醒目通竅、解郁散火、祛風解表、化濕和中[2]。龍腦樟中含有萜類、苯丙素類、揮發(fā)油類及黃酮類等化合物，具有抗炎、降血糖、抗菌、殺蟲、抗腫瘤及抗氧化等藥理活性[3-8]。目前對龍腦樟的研究多數(shù)集中在龍腦樟葉的化學成分、揮發(fā)油和天然冰片的提取[9-11]，對龍腦樟的采后剩余部分（如龍腦樟枝）的研究較少，這不僅對龍腦樟資源造成了浪費，還降低了對龍腦樟資源的綜合利用率。因此，本實驗通過脂多糖（Lipopolysaccharid，LPS）刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞建立體外炎癥模型，以炎癥介質(zhì)NO的產(chǎn)生量為指標研究龍腦樟的抗炎活性，并通過MTT法研究龍腦樟對SH-SY5Y神經(jīng)瘤細胞及HepG2肝癌細胞增殖的抑制作用，以期為進一步開發(fā)龍腦樟資源，提高龍腦樟資源的整體利用率提供理論基礎(chǔ)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：AE29461773），美國HyClone實驗室；NTC胎牛血清（批號：NTC-HK026），阿根廷Natocor工業(yè)；青鏈霉素（批號：G507FA0001）、0.4%臺盼藍染色液（批號：G616FA0001）、噻唑藍（MTT）（批號：A600799-0005）、胰蛋白酶細胞消化液（批號：H617FA0003）、PBS緩沖液（批號：G429FA0001），上海生工生物工程股份有限公司；亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、磺胺、十二烷基硫酸鈉，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；脂多糖（LPS）、二甲基亞砜（DMSO），北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純，天津致遠化學股份有限公司。

龍腦樟枝，由江西樟鄉(xiāng)天然冰片有限責任公司提供，經(jīng)江西省科學院應用化學研究所李雄輝研究員鑒定為龍腦樟枝，樣本編號為PML202102；RAW264.7小鼠巨噬細胞、SH-SY5Y神經(jīng)瘤細胞及HepG2肝癌細胞，由云南農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2 儀器與設備

Esco CellMate二氧化碳培養(yǎng)箱，新加坡Esco科技有限公司；尼康ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡，日本NIKON公司；Tecan INFINITE 200PRO酶標儀，TECAN Austria有限責任公司；TD50002A電子天平，上海衡際科學儀器有限公司；Milli-Q超純水器，密里博公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-260恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DLSB-10L/10低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的提取制備

將龍腦樟枝徹底干燥后粉碎，取粉碎后的龍腦樟枝2.4 kg，按15：1（kg：L）料液比加入80%的乙醇超聲（400 W，30 min）重復提取2次，之后進行抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓濃縮后得到龍腦樟枝乙醇粗提物（Crude，242.42 g），將粗提物加入適量水混合后，用乙酸乙酯萃取，之后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取部位浸膏。用活性炭對乙酸乙酯部位浸膏進行脫色處理，之后冷凍干燥，得到純化后的乙酸乙酯部位樣品（11.82 g）。取適量乙酸乙酯部位樣品加入DMSO配制成100 mg/mL的母液，放于4 ℃冰箱便于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞接種在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞生長至80%左右時，進行傳代培養(yǎng)。SH-SY5Y細胞及HepG2細胞培養(yǎng)方式同上。

1.3.3 抗炎活性測定

（1）Griess法測定NO的釋放量。以NaNO2為標準品，參考BEAK等[12]的方法繪制NO標準曲線。取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，以5×105個/mL的濃度接種于96孔板中，每孔200 μL（四周邊緣用等體積的PBS緩沖液填充），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，設置空白組（只含培養(yǎng)液而無細胞，用于調(diào)零）、對照組、LPS模型組和藥物組?？瞻捉M及對照組加入200 μL培養(yǎng)液（0.1% DMSO），LPS模型組加入200 μL含LPS培養(yǎng)液（0.1% DMSO），藥物組先分別加入含不同濃度龍腦樟枝乙酸乙酯部位的培養(yǎng)液150 μL預處理2 h，再加入50 μL含LPS培養(yǎng)液，每組均設6個復孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24 h。之后每孔取上清液100 μL于96孔板中，加入100 μL配制好的Griess試劑，室溫下反應10 min，在酶標儀540 nm處測定吸光值并代入NO標準曲線計算NO濃度。上述條件中所加藥物終濃度分別為6.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL 及 100.00 μg/mL，LPS終濃度為1 μg/mL。

（2）MTT法測定細胞存活率。參考YANG等[13]測定細胞存活率。接板條件及模型設置同1.3.3（1），加入LPS及藥物孵育24 h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入100 μL 1 mg/mL的MTT培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，最后加入MTT終止液繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h，于570 nm處測定其吸光度并按公式（1）計算存活率。

（3）抗腫瘤活性測定。設置空白組、對照組及藥物組，藥物組加入不同濃度藥物孵育48 h后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入MTT并按1.3.3（2）所示的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞毒性及NO釋放量測定

LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分，可作用于宿主細胞細胞膜表面上的Toll樣受體4刺激細胞產(chǎn)生炎癥[14]。NO可調(diào)節(jié)炎癥和宿主防御并參與到各種慢性疾病中，是一種重要的炎癥介質(zhì)，NO的釋放量也是評價藥物抗炎活性的一項重要指標[15]。龍腦樟枝抗炎活性的測定如圖1（a）、圖1（b）所示。在沒有加入LPS時，對照組中的NO含量極低，僅有1.28 μmol/L，屬于正常水平。經(jīng)過1 μg/mL的LPS刺激后，炎癥反應啟動，NO含量顯著升高（LPS組32.08 μmol/L），表明炎癥模型構(gòu)建成功。通過給予細胞不同濃度的藥物處理，結(jié)果表明，濃度為6.25～100.00 μg/mL范圍內(nèi)的樣品均顯著降低了NO含量，表明龍腦樟枝乙酸乙酯部位有較好的抗炎活性。然而，細胞毒性實驗表明，濃度為12.50～100.00 μg/mL范圍內(nèi)的樣品都顯著地降低了細胞的存活率，表明其對細胞都有不同程度的毒性作用。只有濃度為6.25 μg/mL時，樣品對RAW264.7細胞無明顯毒害作用且能夠顯著降低NO的含量，表明低劑量濃度的龍腦樟枝有較好的NO抑制作用，抗炎活性較強。

圖1 龍腦樟枝乙酸乙酯部位抗炎活性的測定結(jié)果（±SD，n=6）

2.2 抗腫瘤活性測定

龍腦樟乙酸乙酯部位對SH-SY5Y神經(jīng)瘤細胞及HepG2肝癌細胞增殖的抑制作用如圖2（a）與圖2（b）所示。6.25～25.00 μg/mL的樣品對HepG2細胞及SH-SY5Y細胞的存活均無明顯抑制作用，隨著濃度增大為50.00～100.00 μg/mL時，龍腦樟枝均能極顯著抑制HepG2細胞及SH-SY5Y細胞的增殖，表現(xiàn)出一定的劑量效應關(guān)系，且抑制率均在75%以上，表明龍腦樟枝對SH-SY5Y及HepG2細胞有潛在的抗腫瘤活性。

圖2 龍腦樟枝乙酸乙酯部位抗腫瘤活性測定結(jié)果（±SD，n=6）

3 結(jié)論

結(jié)果表明，低劑量的龍腦樟枝乙酸乙酯部位可顯著抑制炎癥介質(zhì)NO的釋放，有一定的抗炎活性；中等劑量的樣品對SH-SY5Y神經(jīng)瘤細胞及HepG2肝癌細胞的增殖有顯著的抑制作用，表明了龍腦樟枝的潛在抗腫瘤活性。研究為后續(xù)活性導向下的單體化合物分離提供了參考，也為提高龍腦樟資源的綜合利用率提供了理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于其具體抗炎機制及抗腫瘤機理尚不清楚，可在后續(xù)的實驗中深入研究。