鐵皮石斛浸膏中有機(jī)溶劑殘留的方法學(xué)研究

夏正晴，謝恩耀

（鑒甄檢測(cè)技術(shù)（上海）有限公司，上海 200137）

鐵皮石斛（Dendrobium of ficinale）在中藥學(xué)中有著舉足輕重的科研價(jià)值，眾多研究表明，其含有豐富的無機(jī)礦物元素、氨基酸、固醇及脂肪酸等物質(zhì)，具有極高的藥用價(jià)值[1-3]。自20世紀(jì)七八十年代起，便拉開了對(duì)鐵皮石斛的研究序幕，鐵皮石斛的繁育及質(zhì)控體系相較于其他中藥材也已相對(duì)成熟[1,4-6]。

全浸膏作為多種中藥制劑生產(chǎn)工藝中主體物料半浸膏的前體原料，其主要工藝流程便是通過水或有機(jī)溶劑（如食用乙醇等）將中藥有效成分浸出，并通過濃縮工藝加工形成的一種膏狀黏稠物，因同時(shí)采用水提及有機(jī)試劑提取工藝，原中藥植株中大量的水溶性及脂溶性有效成分得到了極大的保留，從而得到了廣泛的認(rèn)可[7-9]，而目前眾多針對(duì)中藥材或是制劑的研究中卻鮮有人針對(duì)全浸膏類進(jìn)行質(zhì)控。

隨著人們生活質(zhì)量的逐步提高，人們對(duì)自身保健及疾病醫(yī)療方面的需求也得到了極大的發(fā)展，對(duì)中藥的需求逐漸增加?，F(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的不斷加快使得中藥飲片煎服障礙重重，因此更加高效的中藥丸劑、片劑、膠囊乃至于膏劑便在如今的市場(chǎng)中受到熱捧，但與需求極為不匹配的公眾中藥鑒別能力問題亦日漸突出。本文以當(dāng)前研究較為完善的鐵皮石斛為研究對(duì)象，參照《食品工業(yè)用吸附樹脂產(chǎn)品測(cè)定方法》（GB 24396—2009）中對(duì)有機(jī)溶劑殘留的檢測(cè)方法，對(duì)鐵皮石斛全浸膏中有機(jī)溶劑殘留進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)[10]，從而為完善中藥質(zhì)控體系提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛全浸膏，實(shí)驗(yàn)室自制，陰涼柜保存。

甲醇（MeOH）、二甲基亞砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF），色譜級(jí)，德國(guó)CNW公司；苯、乙醇、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、氯苯、苯乙烯，純度≥99.5%，阿拉丁化學(xué)試劑公司；1,2-二氯乙烷、對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯，純度≥99.5%，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；超純水，默克密理博超純水系統(tǒng)制取，現(xiàn)取現(xiàn)用。

1.2 儀器設(shè)備

7697A-7890B頂空氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；HS20-TQ8050氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；XS105DU電子天平，梅特勒國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；Multipette E3x電子分液器，德國(guó)艾本德股份有限公司；JP-080S超聲波清洗機(jī)，深圳潔盟設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 稀釋液配制

取純水245 mL置于500 mL試劑瓶中，再向其中加入DMSO試劑250 mL，最后加入DMF試劑5 mL，混勻后置于冰水浴中冷卻后制得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

將1.1中所示標(biāo)準(zhǔn)品（除乙醇外）用MeOH分別配制成濃度約為5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，再移取各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液120.0 μL用MeOH定容至10.00 mL，得到約60 μg/mL的溶劑殘留混標(biāo)溶液，記為MMS。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

依次吸取MMS溶液30.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、150.0 μL及200.0 μL置于10 mL容量瓶中用稀釋劑稀釋定容后備用，分別記為L(zhǎng)1（即定量限LOQ）、L2、L3、L4、L5。

1.3.4 檢測(cè)限溶液配制（LOD）

吸取MMS溶液15.0 μL置于10 mL容量瓶中用稀釋劑稀釋定容后備用。

1.3.5 供試品溶液配制

稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密加入稀釋劑溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min即得。

1.3.6 準(zhǔn)確度溶液配制（即ACC溶液）

ACC-L溶液（30%添加水平）：稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密移取標(biāo)曲L1溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min后進(jìn)樣分析。

ACC-M溶液（100%添加水平）：稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密移取標(biāo)曲L3溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min后進(jìn)樣分析。

ACC-H溶液（150%添加水平）：稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密移取標(biāo)曲L4溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min后進(jìn)樣分析。

為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，以上準(zhǔn)確度溶液每個(gè)進(jìn)樣不少于3次。

1.3.7 重復(fù)性溶液配制

配制方法同1.3.6中ACC-M溶液，重復(fù)進(jìn)樣不少于6次。

1.3.8 耐用性溶液配制

配制方法同1.3.6中ACC-M溶液，共配制14組，初始條件進(jìn)樣2次，每個(gè)波動(dòng)條件各進(jìn)樣2次，儀器波動(dòng)條件依據(jù)為進(jìn)樣口溫度±2 ℃，色譜柱初始溫度±2 ℃，色譜柱流速±0.02 mL/min。

1.4 儀器參數(shù)

1.4.1 氣相色譜參數(shù)

色 譜 柱 型 號(hào) 為 CD-WAX（30 m×320 μm×0.5 μm），分流比6∶1，恒流流速1.0 mL/min，升溫程序：40 ℃（6 min），10 ℃/min升溫至150 ℃，以25 ℃/min升溫至220 ℃（2 min），氫火焰檢測(cè)器（FID），檢測(cè)器溫度250 ℃。

1.4.2 頂空參數(shù)

頂空爐溫80 ℃，定量環(huán)溫度90 ℃，傳輸線溫度220 ℃，頂空平衡時(shí)間45 min，定量管填充時(shí)間0.3 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與LOD/LOQ

標(biāo)準(zhǔn)曲線和LOD/LOQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示，受檢的總計(jì)10種常見的有機(jī)溶劑其LOD信噪比均大于3，總體呈現(xiàn)較為完好的結(jié)果，而LOQ的信噪比也均超過了10，綜合各個(gè)目標(biāo)物的線性回歸系數(shù)R2結(jié)果均高于0.995來看，其在180～1 200 ng/mL的濃度區(qū)間內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性，表明此檢測(cè)過程中的儀器參數(shù)符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表2 LOD/LOQ信噪比結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)干擾效應(yīng)，從而導(dǎo)致樣品加標(biāo)的回收率結(jié)果出現(xiàn)浮動(dòng)，無法滿足方法學(xué)的驗(yàn)證要求[11]。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)由于DMSO的強(qiáng)抓取性質(zhì)，通過提高其在稀釋劑中的比例能夠有效降低目標(biāo)物的揮發(fā)水平，當(dāng)采用純DMSO作為稀釋劑時(shí)，部分目標(biāo)物在FID上的響應(yīng)接近于0。且全浸膏中含有較多的揮發(fā)油成分，過高的頂空平衡溫度會(huì)致使供試品中的揮發(fā)油進(jìn)入檢測(cè)器，從而產(chǎn)生較大的基質(zhì)干擾，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不可預(yù)估的影響。因此本研究通過改變稀釋劑中DMSO和水的比例、控制頂空OVEN的溫度及平衡時(shí)間，最終將溶劑的揮發(fā)度保持在較為合理的范圍。

從表3可知，10種溶劑殘留的加標(biāo)回收率最高為116%，分別出現(xiàn)在間二甲苯、氯苯和苯乙烯的低濃度加標(biāo)結(jié)果中，最低為丙烯酸甲酯的98%，總體回收率均處于2020年版《中國(guó)藥典》要求的80%～120%，符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求[12]。

表3 加標(biāo)回收結(jié)果

2.3 重復(fù)性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)采用的是100%濃度加標(biāo)樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，在判定儀器系統(tǒng)穩(wěn)定性的同時(shí)亦對(duì)前處理方法的穩(wěn)定及可靠性進(jìn)行了考察，其最終結(jié)果如表4所示，10個(gè)目標(biāo)物重復(fù)性RSD在0.0%～3.7%，符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定中＜8%的要求[12]。

表4 重復(fù)性結(jié)果

2.4 方法耐用性

各耐用性條件下，同一參數(shù)波動(dòng)中，6份100%濃度加標(biāo)準(zhǔn)確度溶液中各種目標(biāo)物峰面積的RSD均在0.0%～8.3%范圍內(nèi)波動(dòng)，滿足2020年版《中國(guó)藥典》中耐用性RSD＜15%的要求[12]，因此該方法耐用性良好（表5、表6、表7）。

表5 起始柱溫度因素耐用性（峰面積值）

表6 進(jìn)樣口溫度因素耐用性（峰面積值）

表7 流速因素耐用性（峰面積值）

2.5 苯疑似物檢測(cè)結(jié)果

針對(duì)重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線L3中峰面積響應(yīng)結(jié)果差異性問題，筆者進(jìn)行了問題排查，最終發(fā)現(xiàn)是由于頂空進(jìn)樣器盤位有限，因此將準(zhǔn)確度、耐用性編為一組序列（1號(hào)序列），而將重復(fù)性單獨(dú)編組了序列（2號(hào)序列），本文線性數(shù)據(jù)采集自1號(hào)序列組所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，因此與2號(hào)序列組的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了細(xì)微偏差。

進(jìn)一步對(duì)圖1準(zhǔn)確度譜圖分析不難發(fā)現(xiàn)，在溶劑苯的出峰位置存在著一個(gè)極大的干擾峰，導(dǎo)致與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖中苯的保留時(shí)間有所偏移，但總體依舊處于目標(biāo)物苯的出峰時(shí)間范圍內(nèi)，正因如此，造成了兩組不同序列苯的峰面積差異，為了解決這一問題，后續(xù)采用島津GC-MS對(duì)此物質(zhì)進(jìn)行分析研究。

圖1 供試品譜圖

在相同保留時(shí)間，供試品及標(biāo)準(zhǔn)品均有出峰，出峰物質(zhì)經(jīng)NIST譜庫(kù)檢索可知其分別是苯和乙醇（圖2、圖3），后續(xù)加標(biāo)色譜圖如圖4所示，其中圓圈標(biāo)注部分可以發(fā)現(xiàn)乙醇峰及苯峰的峰頂點(diǎn)位置幾乎重疊，因此判定在FID檢測(cè)器上乙醇峰對(duì)有機(jī)溶劑苯的定量產(chǎn)生了少許干擾，在后續(xù)進(jìn)行全浸膏類物質(zhì)質(zhì)量控制過程中，苯的溶劑殘留控制使用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)會(huì)更加的可靠。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

圖3 供試品質(zhì)譜圖

圖4 供試品及加標(biāo)TIC圖

3 結(jié)論

本文對(duì)中藥材鐵皮石斛全浸膏進(jìn)行了有機(jī)溶劑殘留質(zhì)控方法的開發(fā)工作，亦是目前首次針對(duì)全浸膏類產(chǎn)品的質(zhì)控研究，填補(bǔ)了這一領(lǐng)域的空白，為高速發(fā)展的中藥保健品及制劑市場(chǎng)提供一種質(zhì)量溯蹤的依據(jù)。

對(duì)鐵皮石斛全浸膏進(jìn)行有機(jī)溶劑殘留檢測(cè)的方法學(xué)開發(fā)，結(jié)果表明目標(biāo)物在180～1 200 ng/mL的濃度區(qū)間內(nèi)有良好的線性關(guān)系，準(zhǔn)確度、重復(fù)性及方法耐用性均符合藥典要求，此方法完全滿足鐵皮石斛浸膏的質(zhì)控需求。

針對(duì)目標(biāo)物苯的出峰時(shí)間處存在干擾，采用GC-MS的方法進(jìn)行定性，從而確定此處干擾是乙醇造成。由于全浸膏的制作工藝過程中常用水提醇沉法進(jìn)行提取，或使用乙醇進(jìn)行脂溶性營(yíng)養(yǎng)成分的浸提，不可避免的會(huì)帶來乙醇的干擾，研究結(jié)果表明全浸膏類產(chǎn)品溶劑殘留質(zhì)控時(shí)應(yīng)盡可能采用質(zhì)譜法，以減少類似的干擾。