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    心肌肌鈣蛋白I(cTnI)熒光免疫層析試劑研究

    2022-03-29 14:05:34程濤
    生物化工 2022年1期
    關(guān)鍵詞:肌鈣蛋白試劑熒光

    程濤

    (安邦(廈門)生物科技有限公司,福建廈門 361028)

    對于急性心肌梗死患者,發(fā)病90 min內(nèi)為其最佳的時間窗,由于常規(guī)的心肌標(biāo)志物檢測需采集血液后送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測,此過程往往耗時較長,不利于患者診斷及預(yù)后[1]。熒光層析免疫試劑配合便攜式分析儀器可以進(jìn)行床旁采樣、現(xiàn)場檢測,此試劑程序簡單、檢測速度快,對于急診科急性胸痛患者的診斷具有重要臨床意義[2]。本研究研制了心肌肌鈣蛋白 I(cTnⅠ)的熒光免疫層析試劑并進(jìn)行了性能評價,報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鼠抗cTnI單克隆抗體(clon1),珠海博美生物科技有限公司;羊抗cTnI多克隆抗體(clon2),菲鵬生物股份有限公司;熒光微球,200 nm,長沙美牛生物科技有限公司;硝酸纖維素膜,規(guī)格2.5 cm×100 m,默克化工技術(shù)(上海)有限公司;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC),純度≥99%,酪蛋白鈉鹽(casein.Na),純度≥95%,購自Sigma公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;塑料卡,規(guī)格2 cm×10 cm,廈門欣海盛塑膠有限公司;玻璃纖維,杭州韓感科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    KQ-250DE型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;QB-128型旋轉(zhuǎn)混勻儀,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;TGL-20M型高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;HM3230型三維平面點(diǎn)膜噴金儀,上海金標(biāo)生物科技有限公司;ZQ4200型數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī),上海金標(biāo)生物科技有限公司;AF-100型熒光免疫分析儀,安邦(廈門)生物科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 包被板制備

    把硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼在PVC板上。用磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)將羊抗cTnI多克隆抗體及羊抗兔IgG多抗稀釋至1 mg/mL,以1 μL/cm的包被量包被于硝酸纖維素膜上,在濕度≤30%條件下干燥16~24 h,制備得cTnI包被板備用。

    1.3.2 標(biāo)記物制備

    將1 mL熒光微球原液加入到9 mL PBS溶液中,超聲30 s后以18 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min,小心去除上清。加入10 mL PBS溶液,超聲60 s,混勻。取0.4 mL的0.6 mg/mL EDC溶液加入到洗滌后的熒光微球溶液中,用旋轉(zhuǎn)混勻儀混勻1 h,離心(18 000 r/min、30 min),小心去除上清。加入10 mL PBS溶液超聲30 s混勻。以0.5 mg/mL蛋白濃度加入鼠抗cTnI單克隆抗體,在旋轉(zhuǎn)混勻儀上混勻2 h。加入1 mL10%的BSA溶液進(jìn)行封閉,旋轉(zhuǎn)混勻儀上混勻14~18 h。18 000 r/min、離心30 min,小心去除上清,加入10 mL PBS溶液,超聲60 s,標(biāo)記完成,制得cTnI的標(biāo)記物2~8 ℃條件下保存。以相同方法制備兔IgG熒光微球標(biāo)記物。

    1.3.3 標(biāo)記物結(jié)合墊制備

    用標(biāo)記物稀釋液稀釋cTnI標(biāo)記物和兔IgG標(biāo)記物,終濃度為0.1 mg/mL,制得標(biāo)記物噴涂溶液。使用噴金儀以1 μL/cm的噴量把標(biāo)記物噴涂溶液固定在標(biāo)記墊上。噴涂后,標(biāo)記墊放置在濕度≤30%環(huán)境下晾干16~24 h。

    1.3.4 樣品墊制備

    配制樣品墊處理液,10 mmol/L PBS溶液(pH=7.4)中包含0.3 mg/mL的抗RBC和1%的casein.Na,取40 mL樣品墊處理液加在玻璃纖維上,鋪勻液體后在濕度≤30%環(huán)境下干燥16~24 h。

    1.3.5 檢測卡制備

    在包被板上依次放置標(biāo)記物結(jié)合墊和樣品墊。組裝好的檢測板用數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)切成4 mm寬的檢測條,將檢測條放在PVC塑料卡里面壓緊,與干燥劑一起放在鋁箔袋中封裝保存。

    1.3.6 試劑的定標(biāo)

    把國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和cTnI抗原分別用含有1%BSA的10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.0)稀釋制成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、20.0 ng/mL和50.0 ng/mL 6個濃度點(diǎn),用檢測卡進(jìn)行檢測。信號值和濃度值使用四參數(shù)方程進(jìn)行擬合,得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線寫入IC卡中。

    1.3.7 試劑檢測方法

    血清的加樣量為100 μL,全血的加樣量為120 μL。反應(yīng)15 min后進(jìn)行讀數(shù)。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 準(zhǔn)確性

    用cTnI國家標(biāo)準(zhǔn)品制備的參考品,濃度分別為0.3 ng/mL、10 ng/mL,每個濃度參考品均作為樣本各檢測3孔,檢測3次,檢測0.3 ng/mL參考品平均值0.295 ng/mL,相對偏差-1.67%;檢測10 ng/mL參考品平均值10.38 ng/mL,相對偏差3.8%。

    2.2 分析靈敏度

    2.2.1 空白限(LoB)的建立

    用空白樣本(pH=7.0、10 mmol/L PBS溶液+1%BSA)進(jìn)行檢測,每天測試2次,每次重復(fù)測定2次,共測定20次。檢測結(jié)果屬于正態(tài)分布,平均值為0.017,標(biāo)準(zhǔn)偏差SD=0.004,空白限LoB=0.024。

    2.2.2 檢出限(LoD)的建立

    選取5個低濃度樣本,用試劑對各樣本進(jìn)行重復(fù)檢測,每天檢測5次,連續(xù)檢測3 d,最終得到75個低濃度的結(jié)果,如表1所示。

    表1 低值樣本測定結(jié)果(n=15)

    根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析:低濃度樣本檢測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢測,P=0.002<0.05,結(jié)果不呈正態(tài)分布,按非參數(shù)方法估計(jì)LoD。取0.07 ng/mL作為試劑的檢出限。

    2.3 精密性

    取心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測定試劑盒(熒光免疫層析法),分別用濃度為0.3 ng/mL、10.0 ng/mL的參考品進(jìn)行檢測,每天檢測1次,每次每個濃度平行檢測2次,連續(xù)檢測20 d,進(jìn)行精密度分析;2個濃度參考品檢測結(jié)果的變異系數(shù)分別是7.54%和9.00%。

    2.4 特異性

    心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣蛋白C(cTnC)、骨骼肌型肌鈣蛋白I(sTnI)分別用參考品稀釋液進(jìn)行稀釋,制備成濃度為1 000 ng/mL的特異性樣本;用試劑分別檢測上述制備樣本,每個樣本平行檢測3次。檢測結(jié)果表明,在1 000 ng/mL濃度條件下,cTnI檢測結(jié)果均<0.07 ng/mL,未出現(xiàn)非特異反應(yīng)現(xiàn)象。

    2.5 干擾試驗(yàn)

    按照1 mL高、中、低濃度樣本+0.1 mL PBS溶液(10 mmol/L、pH=7.0,含1% BSA)的方式制得對照樣本,按照1 mL樣本+0.1 mL干擾物溶液(3 850 μmol/L膽紅素、440 mmol/L甘油三酯、22 g/L血紅蛋白和16 500 IU/mL類風(fēng)濕因子)的方式制得干擾樣本。用檢測試劑分別檢測對照樣本和干擾樣本,計(jì)算與對照樣本的相對偏差,結(jié)果見表2。由表2可知,干擾物在實(shí)驗(yàn)濃度條件下不影響樣本檢測結(jié)果。

    表2 干擾實(shí)驗(yàn)樣本檢測結(jié)果

    2.6 線性范圍

    將cTnI抗原用參考品稀釋液進(jìn)行稀釋,配制成系列濃度點(diǎn)。檢測系列濃度點(diǎn)樣本,每個樣本測試3次,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用該曲線方程計(jì)算濃度樣本的測定值,以理論濃度(x)為自變量,以檢測結(jié)果均值(y)為因變量進(jìn)行線性回歸,繪制出劑量反應(yīng)曲線,確定線性范圍。如圖1所示,試劑線性方程y=1.001 7x-0.003 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。因此,心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測定試劑盒(熒光免疫層析法)的線性范圍為0.1~50.0 ng/mL。

    圖1 濃度線性圖

    2.7 血清、血漿和全血檢測對比

    準(zhǔn)備好6種不同顏色的真空采血管,用于采集血樣制備血清、抗凝血漿樣本,以紅色采樣管的血清樣本結(jié)果為基準(zhǔn),比較其他血清、血漿樣本對檢測結(jié)果的影響,見表3。準(zhǔn)備5組樣本,紅細(xì)胞壓積分別為20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%及60%~70%。以血漿樣本結(jié)果為基準(zhǔn),比較不同紅細(xì)胞壓積全血樣本對檢測結(jié)果的影響,見表4。結(jié)果顯示,紅細(xì)胞壓積在30%~50%范圍內(nèi)對檢測結(jié)果與血漿相比無顯著性差異。常規(guī)的促凝劑采血管(橘紅色)、惰性分離膠采血管(黃色)、肝素鈉抗凝劑采血管(綠色)、EDTA-K2抗凝劑采血管(紫色)及枸櫞酸鈉抗凝劑采血管(藍(lán)色)檢測結(jié)果與血清管(紅色)一致,不同采血管均不影響試劑的檢測結(jié)果。

    表3 血清與血漿樣本檢測結(jié)果

    表4 不同紅細(xì)胞壓積率全血樣本統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

    2.8 臨床性能驗(yàn)證

    采用與已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的產(chǎn)品進(jìn)行同步盲法對比試驗(yàn)研究,考察考核試劑的臨床應(yīng)用性能與該已上市產(chǎn)品的等效性。104例樣本的檢測結(jié)果見表5。

    表5 104例樣本檢測結(jié)果的符合率

    Bland-Altman一致性評價[3]:所有的點(diǎn)均在95%一致性界限以內(nèi);在一致性界限范圍內(nèi),比值均在0.8~1.2,認(rèn)為兩種方法具有較好的一致性。

    2.9 分段回歸分析

    分段回歸分析結(jié)果如圖2、圖3。其中圖2為對比試劑檢測值<2的回歸分析,圖3為對比試劑檢測值≥2的回歸分析。

    圖2 考核試劑與對比試劑測試結(jié)果線性圖(R2=0.971 6)

    圖3 考核試劑與對比試劑測試結(jié)果線性圖(R2=0.978 8)

    104例血清樣本中,1例樣本對比試劑檢測結(jié)果為陽性,考核試劑檢測結(jié)果為陰性;1例樣本對比試劑檢測結(jié)果為陰性,考核試劑檢測結(jié)果為陽性;該2例樣本兩種試劑檢測結(jié)果均在參考值附近,認(rèn)為該樣本屬于臨界值樣本。本心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測定試劑盒(熒光免疫層析法)與已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的產(chǎn)品的檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且具有高度一致性。

    3 結(jié)論

    近年來,我國急性心肌梗死的發(fā)病率越來越高,且發(fā)病逐漸年輕化。WHO推薦指南將心電圖、cTnI等心肌酶譜檢測視為臨床診斷急性心肌梗死的金標(biāo)準(zhǔn)。在臨床中,縮短急性心肌梗死的診斷時間對于患者預(yù)后具有重要的臨床意義。對研制的cTnI熒光免疫層析試劑進(jìn)行評價,結(jié)果表明該試劑準(zhǔn)確度高,靈敏度好,抗干擾能力強(qiáng),臨床檢測符合性好,作為化學(xué)發(fā)光試劑和其他同類型試劑的有益補(bǔ)充,可以在急診科急性胸痛患者的診斷中發(fā)揮出重要的臨床價值。

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