氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）化學(xué)發(fā)光免疫凍干微球定量檢測試劑研究

陳珠金

（安邦（廈門）生物科技有限公司，福建廈門 361000）

腦鈉肽（Brain Natriuretic Peptide，BNP）實(shí)際上主要來源于心室，因其由日本學(xué)者SUDOH[1]1988年首次從豬腦中提取出來而得名。BNP主要由心室肌細(xì)胞合成和分泌，具有較強(qiáng)的舒張血管作用，可抵御容量負(fù)荷過重及高血壓，心室負(fù)荷增加能導(dǎo)致BNP釋放。氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）是腦鈉肽前體之一，是BNP激素原分裂后沒有活性的N-末端片段，主要由左心室分泌。與BNP相比，NT-proBNP半衰期更長，更穩(wěn)定，其濃度可反映短暫時(shí)間內(nèi)新合成的而不是貯存的BNP釋放。近年來的研究表明，血清NT-proBNP水平在高血壓診斷、心力衰竭的預(yù)后判斷與治療指導(dǎo)方面有重要價(jià)值[2-3]。

化學(xué)發(fā)光法檢測NT-proBNP能做到定量檢測，但發(fā)光免疫試劑在保存和運(yùn)輸條件上要求苛刻，一般需要保存在2～8 ℃，需要冷鏈運(yùn)輸。這些條件如果得不到滿足，會對發(fā)光免疫試劑的性能造成很大的影響，甚至導(dǎo)致試劑失效。本文研制的試劑可實(shí)現(xiàn)常溫儲存且單人份包裝，以羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)NT-proBNP Ab1，利用吖啶磺酰胺標(biāo)記NT-proBNP Ab2，添加試劑儲存劑，二者混合，利用液氮點(diǎn)樣儀器點(diǎn)樣，形成冷凍微球，將冷凍微球轉(zhuǎn)入凍干機(jī)，真空冷凍干燥后充保護(hù)氣體分裝保存。檢測時(shí)，加入純化水與待測樣本，等到待測物中的NT-proBNP抗原與試劑混合后，形成雙抗體夾心復(fù)合物結(jié)合在磁珠上，清洗分離，復(fù)合物在激發(fā)液的作用下發(fā)光，相對發(fā)光強(qiáng)度（RLU）與樣本中的NT-proBNP抗原濃度呈正相關(guān)。從而研制出直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量檢測氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）的凍干微球單人份包裝試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

NT-proBNP配對抗體，菲鵬生物股份有限公司；NT-proBNP校準(zhǔn)品，上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；人血清白蛋白、膽紅素、血紅素、甘油三酯，Sigma-Aldrich公司；磁性微球（羧基，2.9 μm），日本JSR株式會社；吖啶磺酰胺（NSP-SA-NHS），深圳市美凱特科技有限公司；脫鹽柱，Thermo Fisher公司；二甲基甲酰胺（DMF）、賴氨酸、酪蛋白、牛血清白蛋白BSA，Sigma-Aldrich公司；甘露醇、海藻糖、明膠、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙二醇PEG20000，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SMART 500全自動化學(xué)發(fā)光測定儀，重慶科斯邁生物科技有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.1.3 臨床樣本

定值人血清100例（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院提供，定值結(jié)果由羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制方法

（1）試劑儲存液配制：甘露醇5%，海藻糖10%，酪蛋白1%，吐溫20 0.01%、明膠0.5%以及防腐劑0.1%，硫代硫酸鈉5 mmol/mL；乙二胺四乙酸二鈉5 mmol/mL，用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）（pH7.0～7.4，50 mmol）溶解稀釋以上組分到相應(yīng)的濃度。

（2）激發(fā)液配制：激發(fā)液A為0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3，激發(fā)液B為0.2 mol/L的NaOH+1%的TritonX-100。

1.2.2 磁性微球偶聯(lián)NT-proBNP-Ab1制備（試劑A）

取10 mg羧基修飾的磁性微球混懸液于樣品管中，加入900 μL的2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）溶液（pH5.0，0.1 mol/mL）混勻，然后分別加入100 μL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）溶液（10 mg/mL）和200 μL的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶液（10 mg/mL），室溫反應(yīng)30 min，活化磁性微球；去上清，磁珠重新混懸液于1 mL的MES溶液（pH5.0，0.1 mol/mL）；隨后直接加入100 μg的鱗癌抗原抗體1，37 ℃孵育3 h；去上清，加入50 μL的BSA（10 mg/mL）室溫封閉1 h后，用0.025 mol/mL的TBST（即 TBS with Tween-20，含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 這3種物質(zhì)）緩沖液洗滌4次，除去游離抗體，加入試劑儲存液10 mL，制備成試劑A。

1.2.3 吖啶磺酰胺標(biāo)記NT-proBNP-Ab2制備（試劑B）

取適量抗體，用碳酸鹽緩沖液（pH9.6，50 mmol/L）稀釋至1 mg/mL，脫鹽柱純化；計(jì)算抗體的摩爾數(shù)，在純化后的抗體中加入15倍摩爾數(shù)的吖啶磺酰胺（DMF稀釋），4 ℃避光反應(yīng)1 h；加入20倍抗體摩爾數(shù)的賴氨酸避光反應(yīng)30 min，用高效液相色譜（流動相為pH6.5、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，分子篩色譜柱，檢測波長280 nm）純化標(biāo)記后的復(fù)合物，加入等體積甘油在-20 ℃凍存，使用時(shí)用試劑儲存液稀釋至抗體濃度為0.001 mg/mL，制備成試劑B。

1.2.4 試劑點(diǎn)樣凍干

試劑A與試劑B按1∶1混合均勻，加入到液氮點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣量每滴為20 μL，點(diǎn)樣形成冷凍微球，將冷凍微球轉(zhuǎn)入凍干機(jī)，冷凍干燥后充保護(hù)氣體分裝保存。

1.2.5 樣品檢測

30 μL待測樣本和120 μL去離子水加入到帶有凍干微球試劑的樣品杯中；37 ℃條件下溫育10 min后，洗滌液清洗3次，最后加入激發(fā)液A和激發(fā)液B各100 μL，檢測相對發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

在免疫反應(yīng)中，對NT-proBNP采用3個(gè)平行孔測定后取其平均值，相對發(fā)光強(qiáng)度（RLU）和相應(yīng)濃度進(jìn)行4參量擬合，建立主校準(zhǔn)曲線，掃描到儀器中。通過所保存的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，檢測相應(yīng)樣本時(shí)系統(tǒng)軟件自動地確定病人的測試結(jié)果，結(jié)果單位以pmol/mL的形式給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑外觀及理化性質(zhì)

試劑呈均勻光滑的圓球狀固體，加純化水，微球迅速崩解復(fù)溶成均勻帶有磁珠粉末的混懸液，磁珠不團(tuán)聚，液體除磁珠粉末外無其他未溶解物。

2.2 線性范圍

將接近線性范圍上限標(biāo)準(zhǔn)品（35 000 pmol/mL）的樣本用正常人血清稀釋6個(gè)濃度，其中稀釋的最小濃度20 pmol/mL接近線性范圍下限。對每一個(gè)樣本均檢測3次，計(jì)算平均值，相對發(fā)光強(qiáng)度值做直線擬合。如圖1所示，線性范圍（20～35 000 pmol/mL）內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999，顯示了良好的相關(guān)性。

圖1 化學(xué)發(fā)光法凍干微球試劑測定NT-proBNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 最低檢出限

用零濃度校準(zhǔn)品作為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測度20次，得出20次檢測結(jié)果的RLU值，計(jì)算其平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），將+2SD所對應(yīng)的RLU值帶入主校準(zhǔn)曲線中，求出對應(yīng)的濃度值，結(jié)果不高于20 pmol/mL，因此設(shè)定20 pmol/mL即為最低檢出限。

2.4 精密性

批內(nèi)精密性，用1 000 pmol/mL和10 000 pmol/mL濃度NT-proBNP，每個(gè)濃度平行檢測10次，分別求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），求得批內(nèi)變異系數(shù)＜5%。

2.5 回收率

將3例高值樣本加入到3份正常人血清樣品（內(nèi)源性檢測濃度均低于100 pmol/mL）中，所加入高值樣本與正常人血清之間體積比為1∶9，平均回收率95.7%。

2.6 穩(wěn)定性

將試劑在45 ℃放置90 d，檢測NT-proBNP，相對發(fā)光強(qiáng)度與放置前對比，確定45 ℃儲存90 d熱穩(wěn)定性的變化幅度≤10%；按試劑儲存條件（25 ℃±5 ℃）放置5個(gè)月，檢測標(biāo)準(zhǔn)品，相對發(fā)光強(qiáng)度與放置前對比，穩(wěn)定性的變化幅度≤10%。本方法制得的試劑與常規(guī)化學(xué)發(fā)光試劑相比穩(wěn)定性顯著升高。

2.7 比對試驗(yàn)

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院提供的57例臨床標(biāo)本，用研究試劑盒測定，并與羅氏電化學(xué)發(fā)光測定結(jié)果對比，結(jié)果如圖2所示。回歸方程y=0.994 2x+173.13，相關(guān)系數(shù)R2=0.976 4，表明兩者測試血清中NT-proBNP抗原的含量具有良好的相關(guān)性。

圖2 本研究試劑檢測結(jié)果與羅氏電化學(xué)試劑檢測結(jié)果相關(guān)性

2.8 特異性

如表1所示，通過對常見的干擾因素（人血清白蛋白、甘油三酯、血紅素、膽紅素以及BNP）對檢測結(jié)果的影響判定方法的特異性，干擾物測定值均小于20 pmol/mL，表明該方法具有良好的特異性。

表1 試劑特異性分析

3 結(jié)論

近年來，我國心力衰竭發(fā)病率不斷升高，有資料顯示我國患有心血管疾病的患者約為2.9億人，其中心衰患者約占15.5%[4]。在臨床治療中，早期診斷具有重要價(jià)值，可有效控制患者病情，避免患者病情加重。臨床研究證實(shí)，當(dāng)發(fā)生心力衰竭時(shí)，NT-proBNP水平均會顯著上升，其幅度與心力衰竭的嚴(yán)重程度正相關(guān)；病情緩解或有效治療后回降，但難以完全恢復(fù)到健康人水平。因此NT-proBNP的檢測是心力衰竭患者鑒別診斷、預(yù)后評定和指導(dǎo)治療中的重要指標(biāo)。研究提出，NT-proBNP濃度對早期心衰患者具有診斷價(jià)值[5]。

化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immuno-Assay，CLIA）是在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)，可以根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度確定物質(zhì)的含量，該方法在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[6]。凍干工藝可有效解決發(fā)光免疫試劑不能常溫保存與運(yùn)輸?shù)膯栴}。

本文成功研制了可實(shí)現(xiàn)單人份包裝常溫儲存的化學(xué)發(fā)光免疫試劑，具有靈敏度高、特異性好、線性范圍廣，穩(wěn)定性好，可常溫儲存等特點(diǎn)，能夠滿足臨床檢測的需要，指導(dǎo)心衰患者的臨床診斷和治療，為患者治療提供可靠的數(shù)據(jù)支持。