石楠藤多糖的提取及其抗氧化活性研究

覃亮，劉航博，韋宇，吳貽淋，周曉橦，戴思敏

（肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

石楠藤為胡椒科植物毛蒟[Piper puberulum(Benth.)Maxim.]的干燥枝葉，又名爬巖香、巴巖香等，性辛，溫，歸肝、脾經(jīng)，常用于治療風(fēng)寒濕痹、筋骨疼痛[1-2]。研究表明，石楠藤的化學(xué)成分主要有木脂素、新木脂素類、酰胺生物堿類、有機酸、甾醇類和揮發(fā)油等[3-4]。我國科研工作者對石楠藤含有的有效成分做了大量活性研究。許寶華等[5]發(fā)現(xiàn)，石楠藤提取物對急性出血性壞死性胰腺炎大鼠內(nèi)毒素血癥具有較好的防治作用。陳少奇等[6]發(fā)現(xiàn)，石楠藤提取物使小鼠的逃避潛伏期以及尋找平臺游泳距離均出現(xiàn)明顯地縮短（P＜0.05），明顯提高AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，拮抗或修復(fù)Aβ25-35對小鼠學(xué)習(xí)能力的損傷。為拓展人們對石楠藤應(yīng)用價值的認(rèn)識，本試驗將優(yōu)化石楠藤多糖提取工藝，并評價其抗氧化活性，為石楠藤作為藥用植物資源的進一步開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石楠藤，廣東清源中藥飲片有限公司（批號：1952167）。

1,1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH，C14114102）、二甲基亞砜（DMSO，C17354346），上海麥克林生化科技有限公司；石油醚、無水乙醇、葡萄糖、苯酚等，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用水為蒸餾水。

XL-30C新型高速連續(xù)式超微粉碎機，廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司；TDL-40C低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥材的脫脂處理

石楠藤粉末以石油醚為溶劑，索式提取法脫脂，藥渣置于通風(fēng)處晾干，得到脫脂石楠藤干粉，備用。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取0.1 mg/mL葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL，到標(biāo)好序號的試管中，并用膠頭滴管滴加蒸餾水到2.0 mL，使之濃度稀釋為0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL、0.030 mg/mL、0.035 mg/mL和0.040 mg/mL，往試管依次滴加1.0 mL的5%苯酚溶液，輕輕振蕩加搖動，小心準(zhǔn)確地加入濃硫酸5.0 mL，靜置數(shù)分鐘。根據(jù)紫外分光光度法，在490 nm處記錄吸光度[7]。以葡萄糖溶液的濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以葡萄糖溶液的吸光度A為縱坐標(biāo)，即得線性方程A=23.711X-0.1148，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，可見在0.010～0.040 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3 單因素試驗

（1）提取溫度對石楠藤多糖提取率的影響。采用水提醇沉法提取石楠藤多糖，具體工藝為：將脫脂石楠藤粉末50 g置于圓底燒瓶中，加入2 L蒸餾水，分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃條件下加熱攪拌提取60 min，過濾得粗多糖溶液。溶液經(jīng)脫蛋白、脫色后，再次過濾，濃縮，加入無水乙醇至乙醇含量為60%，醇沉過夜，離心得粗多糖，冷凍干燥24 h，取出存好，備用。實驗重復(fù)3次，多糖得率的計算如式（1）。

式（1）中，m為多糖質(zhì)量，g；M為脫脂石楠藤粉末的質(zhì)量，g。

（2）提取時間對石楠藤多糖提取率的影響。參考（1）的方法，料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度80 ℃，加熱攪拌50 min、60 min、70 min、80 min和90 min，提取液經(jīng)脫蛋白、脫色、濃縮處理后，加入無水乙醇至乙醇含量為60%，醇沉得到多糖并按式（1）計算多糖得率。

（3）料液比對石楠藤多糖提取率的影響。參考（1）的方法，提取溫度80 ℃，提取時間70 min，料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60（g∶mL），提取液經(jīng)脫蛋白、脫色、濃縮處理后，加入無水乙醇至乙醇含量為60%，醇沉得到多糖并按式（1）計算多糖得率。

（4）醇沉體積分?jǐn)?shù)含量對石楠藤多糖提取率的影響。參考（1）的方法，料液比1∶50（g∶mL）、提取溫度80 ℃，提取時間70 min，提取液經(jīng)脫蛋白、脫色、濃縮處理后，分別加入無水乙醇至乙醇含量為50%、60%、70%、80%和90%，醇沉得到多糖并按式（1）計算多糖得率。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取溫度、提取時間、料液比和醇沉體積分?jǐn)?shù)作為影響因素，設(shè)計L9（34）正交試驗（見表1），每組3個平行。

表1 正交試驗設(shè)計表

1.2.5 多糖抗氧化試驗

將2 mL的0.2 mmol/L DPPH（溶于95%乙醇中）添加到2 mL的樣品溶液中?；旌暇鶆蚝笤谑覝叵卤芄夥磻?yīng)15 min，在517 nm處測量上清液的吸光度，清除率計算公式如式（2）[8]。

對照用無水乙醇代替DPPH進行，無水乙醇替代樣品作空白，維生素C用作陽性標(biāo)準(zhǔn)，每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

溫度對多糖提取率的影響如圖1所示，當(dāng)溫度達到80 ℃時，石楠藤多糖提取率達到最高，隨后多糖的提取率開始下降，因此選擇70 ℃、80 ℃、90 ℃作進一步優(yōu)化。提取時間對多糖含量的影響如圖2所示，當(dāng)提取時間為60 min時，多糖提取率達到最高，隨后提取率趨于平緩并有下降趨勢，因此選擇60 min、70 min、80 min作進一步優(yōu)化。料液比對多糖含量的影響如圖3所示，多糖提取率隨著料液比的增大逐漸上升，當(dāng)料液比達到1∶50（g ：mL）時多糖提取率達到最高，隨后趨于平穩(wěn)，因此選擇1∶40、1∶50、1∶60（g ：mL）的料液比作進一步優(yōu)化。醇沉體積分?jǐn)?shù)對多糖含量的影響如圖4所示，當(dāng)醇沉體積分?jǐn)?shù)為60%時，多糖提取率達到最高，隨后提取率趨于平緩，故選擇50%、60%、70%作進一步優(yōu)化。

圖1 提取溫度對多糖含量的影響

圖2 提取時間對多糖含量的影響

圖3 料液比對多糖含量的影響

圖4 醇沉體積分?jǐn)?shù)對多糖含量的影響

2.2 正交優(yōu)化多糖提取工藝

從表2可知，石楠藤多糖提取各因素影響程度依次為醇沉體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時間，最優(yōu)提取工藝為A2B2C2D3，即提取溫度為80 ℃，提取時間70 min，料液比為1∶50（g ：mL），醇沉體積分?jǐn)?shù)為70%。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 驗證試驗

為驗證工藝的穩(wěn)定性，按照優(yōu)化的工藝平行提取3次，多糖提取率分別為5.38%、5.40%、5.36%，工藝穩(wěn)定性良好。

2.4 多糖抗氧化試驗

試驗結(jié)果表明（圖5），當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.2～5.0 mg/mL時，石楠藤多糖對DPPH·的清除率隨著多糖濃度的增加而增加，半最大效應(yīng)濃度（EC50）為0.801 mg/mL。

圖5 多糖對DPPH·清除率的影響

3 結(jié)論

本文對石楠藤多糖進行了研究，通過正交試驗確定了最優(yōu)提取工藝，即提取溫度為80 ℃、提取時間70 min、料液比為1∶50（g ：mL）、醇沉體積分?jǐn)?shù)為70%。深入研究發(fā)現(xiàn)，石楠藤多糖對DPPH·表現(xiàn)出較好的清除效果，EC50為0.801 mg/mL。石楠藤作為廣東地區(qū)常見的一味中藥材，許多有效成分尚未被人發(fā)現(xiàn)，本文對其多糖的提取和抗氧化活性進行了初步研究，為石楠藤資源的深入研究提供了實驗基礎(chǔ)。