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    雙重PCR檢測(cè)海產(chǎn)品中攜帶trh毒力基因副溶血性弧菌的研究

    2022-03-29 14:05:28劉月蘋(píng)
    生物化工 2022年1期
    關(guān)鍵詞:溶血性弧菌雙重

    劉月蘋(píng)

    (1.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北唐山 063004;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110866)

    副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是引起人類(lèi)腸胃炎的一種致病菌,常存在于人們食用的貝類(lèi)產(chǎn)品及魚(yú)類(lèi)中,其主要致病機(jī)理是該菌可產(chǎn)生溶血毒素,包括耐熱性溶血毒素(TDH)、耐熱性溶血毒素相關(guān)的溶血毒素(TRH)及不耐熱溶血毒素(TLH),其中TDH和TRH是副溶血性弧菌的主要致病因子。近幾年來(lái),副溶血性弧菌已超過(guò)沙門(mén)氏菌成為危害性最大的食源性病原菌,其引起的食源性致病案例更是呈明顯上升趨勢(shì)。因此,研究開(kāi)發(fā)可快速檢測(cè)致病性的副溶血性弧菌的方法至關(guān)重要。

    傳統(tǒng)檢測(cè)方法大多要經(jīng)過(guò)增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過(guò)程,操作時(shí)間長(zhǎng),步驟煩瑣,檢出率也較低。宋晶玲[1]利用神奈川試驗(yàn)與PCR檢測(cè)183株O3:K6血清型副溶血性弧菌毒力基因時(shí)發(fā)現(xiàn)神奈川試驗(yàn)存在部分trh基因的漏檢,而采用實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)、基因芯片與脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)等方法檢測(cè)副溶血性弧菌的技術(shù)含量高,使用設(shè)備價(jià)格昂貴[2]。

    因此,本研究采用種特異性基因tlh和毒力基因trh為模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,在確定副溶血性弧菌種屬的基礎(chǔ)上進(jìn)行trh毒力基因的檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行雙重PCR的靈敏度及人工污染靈敏度的檢測(cè),初步建立了準(zhǔn)確檢測(cè)攜帶致病基因trh的副溶血性弧菌的雙重PCR技術(shù),并且提高了檢測(cè)靈敏度和特異性,避免了神奈川試驗(yàn)假陽(yáng)性的干擾,節(jié)約時(shí)間和材料成本。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株

    標(biāo)準(zhǔn)菌株:副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802,沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

    試驗(yàn)菌株:微生物生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的非副溶血性弧菌,包括李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、創(chuàng)傷弧菌、熱帶假絲酵母、傷寒沙門(mén)氏菌和芽孢桿菌。

    1.1.2 試劑與儀器

    Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer和6×Loading Buffer,TAKARA公司;EB,Sigma公司;DL 2 000 marker,上海生工生物工程公司;瓊脂糖,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

    UV-10000型凝膠成像儀,驥輝分析儀器(上海)有限公司;T100型PCR儀,美國(guó)伯樂(lè)公司;721型紫外分光光度計(jì),上海菁華科技儀器有限公司。

    PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì),由TAKARA公司合成,如表1所示。

    表1 tlh和trh基因的引物序列

    反應(yīng)體系:3.75 pmol/μL的tlh引物對(duì)各1 μL,3.75 pmol/μL的trh引物對(duì)各4 μL,2.5 μL的10×buffer( 含 Mg2+),2.0 μL 的 2.5 mmol/L 的 dNTP,4 μL的 DNA 模板,0.2 μL 的 Taq酶(5 U/μL),補(bǔ)水至反應(yīng)體系25 μL。

    反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃,5 min;變性94 ℃,1 min;退火 55 ℃,1 min;延伸 72 ℃,2 min;循環(huán) 29次;最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后,72 ℃延伸10 min。雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,成像系統(tǒng)成像。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株培養(yǎng)

    取4 ℃保存的斜面菌種進(jìn)行活化,挑取生長(zhǎng)菌一環(huán),接種到盛有50 mL培養(yǎng)基的三角瓶中37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,所用培養(yǎng)基為胰胨肉湯。

    1.2.2 模板DNA的提取

    取0.6 mL對(duì)數(shù)期菌懸液與0.6 mL的2×TZ細(xì)胞裂解液混勻,使TZ工作濃度為2.0%的Triton X-100,2.5 mg/mL的疊氮化鈉,0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液,pH 8.0。沸水浴10 min后冷卻到室溫,15 000 r/min離心10 min,取上清(含DNA)備用。

    1.2.3 PCR體系優(yōu)化及產(chǎn)物分析

    在確定了反應(yīng)體系為25 μL后,通過(guò)多次試驗(yàn)先確定了影響較小的因素:10×Buffer(含Mg2+),2.5 μL;2.5 mmol/L 的 dNTP,2.0 μL;Taq 酶 0.2 μL,DNA模板4 μL。對(duì)影響較大的引物濃度和退火溫度進(jìn)行調(diào)試,其中退火溫度調(diào)試范圍為在50.8~59.2 ℃;trh和tlh的引物濃度均為3.75 pmol/μL,由于之前做單重PCR檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)引物trh用量為4 μL時(shí),PCR擴(kuò)增條帶亮度很亮,所以本試驗(yàn)采用trh引物用量為4 μL,tlh的引物用量范圍為0.5~4.0 μL。PCR反應(yīng)條件同1.1.2。

    1.2.4 PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)

    采用TZ法分別提取副溶血性弧菌ATCC17802和7株非副溶血性弧菌的DNA,并利用優(yōu)化的雙重PCR體系進(jìn)行DNA理論擴(kuò)增反應(yīng)與電泳檢測(cè)分析。

    1.2.5 驗(yàn)證雙重PCR檢測(cè)體系

    活化試驗(yàn)室保存的利用傳統(tǒng)方法從海產(chǎn)品中篩選出的副溶血性弧菌菌株,用雙重PCR進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.6 PCR靈敏度檢測(cè)[3]

    取對(duì)數(shù)期副溶血性弧菌懸液10 mL,12 000 r/min離心1 min,棄上清,用生理鹽水在8 000 r/min,3 min條件下洗滌2次后,用生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)瑴y(cè)定其600 nm吸光度值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定菌濃度為2.0×107CFU/mL,之后用生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e取稀釋菌液0.5 mL抽提DNA進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.7 人工模擬樣品檢測(cè)

    取菌濃度1.45×108CFU/mL的副溶血性弧菌0.5 mL,分別接入經(jīng)檢測(cè)無(wú)副溶血性弧菌的5 g碎牡蠣肉、碎蝦肉、碎海鲇魚(yú)肉及魚(yú)鰓和魚(yú)腸中,胰胨肉湯培養(yǎng)基,37 ℃、160 r/min增菌10 h,抽提DNA進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.8 人工污染靈敏度檢測(cè)

    取經(jīng)檢測(cè)無(wú)副溶血性弧菌的黃花魚(yú)肉5 g,無(wú)菌操作下剪碎,分別放入盛有45 mL胰胨肉湯培養(yǎng)液的9個(gè)三角瓶中,取經(jīng)過(guò)生理鹽水稀釋?zhuān)鷿舛葹?.0×108CFU/mL副溶血性弧菌進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e取0.5 mL稀釋液放于三角瓶中,37 ℃、160 r/min培養(yǎng)10 h,從液面取0.5 mL增菌液進(jìn)行DNA提取,雙重PCR檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR體系優(yōu)化及產(chǎn)物分析

    影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的因素很多,其中兩個(gè)重要參數(shù)就是退火溫度和引物濃度[4]。首先利用PCR儀優(yōu)化退火溫度(圖1),在最佳的退火溫度下根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的亮暗調(diào)整引物濃度,以便使用較少的引物達(dá)到最佳的效果。

    圖1 退火溫度優(yōu)化

    由圖1可知,退火溫度在50.8~59.2 ℃內(nèi),擴(kuò)增片段為450 bp的條帶亮度都很強(qiáng),300 bp的條帶亮度隨著退火溫度的降低亮度變強(qiáng),而降低退火溫度可以提高PCR擴(kuò)增效率,因此選擇55 ℃為最佳退火溫度。

    由圖2可知,在固定trh引物用量、變化tlh引物用量的情況下,擴(kuò)增片段300 bp的條帶亮度都很弱,引物用量超過(guò)1.0 μL后亮度無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)要求;而擴(kuò)增片段為450 bp的條帶亮度隨用量的增加而增加。在3.75 pmol/μL的tlh引物對(duì)各1.0 μL,與3.75 pmol/μL的trh引物對(duì)各4 μL時(shí),雙重PCR條帶亮度能夠達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

    圖2 引物濃度優(yōu)化

    2.2 特異性分析

    采取TZ法對(duì)各種待測(cè)菌株進(jìn)行DNA的抽提,之后分別加入兩種引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增(圖3)。

    圖3 雙重PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果

    由圖3可知,利用優(yōu)化的雙重PCR對(duì)兩株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802的DNA進(jìn)行擴(kuò)增可獲得大小為450 bp和300 bp的兩條清晰的目的條帶,而非副溶血性弧菌沒(méi)有特異性條帶產(chǎn)生。說(shuō)明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)體系具有極好的特異性和穩(wěn)定性。

    2.3 驗(yàn)證雙重PCR檢測(cè)體系

    由圖4可知,雙重PCR方法與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果一致。5株經(jīng)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)與生化鑒定為副溶血性弧菌的菌株進(jìn)行雙重PCR檢測(cè),所有菌株均擴(kuò)增出tlh特異性條帶,而有些副溶血性弧菌還擴(kuò)增出trh毒力基因。說(shuō)明tlh可作為PCR鑒定副溶血性弧菌的菌屬特異性基因,該雙重PCR方法能夠準(zhǔn)確地鑒定出攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌。

    圖4 雙重PCR檢測(cè)5株傳統(tǒng)方法檢測(cè)出的副溶血性弧菌

    2.4 雙重PCR靈敏度分析

    濃度為2.0×108CFU/mL的副溶血性弧菌培養(yǎng)液以十倍稀釋法稀釋?zhuān)M(jìn)行PCR檢測(cè)。擴(kuò)增條帶的亮度隨著菌液濃度的減小而減弱;菌濃度為2.0×104CFU/mL時(shí),450 bp和300 bp的目的片段都可擴(kuò)增出來(lái);菌濃度為2.0×103CFU/mL、2.0×102CFU/mL和2.0×10 CFU/mL時(shí),只有條帶亮度很弱的450 bp片段;濃度2.0 CFU/mL時(shí)雙重PCR擴(kuò)增條帶均消失(圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雙重PCR對(duì)攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌的純菌菌液靈敏度可達(dá)到2.0×104CFU/mL,此靈敏度可滿(mǎn)足樣本增菌后的檢測(cè)要求。

    圖5 雙重PCR的靈敏度分析

    2.5 人工污染樣品檢測(cè)

    取濃度為1.45×108CFU/mL的副溶血性弧菌,接種于盛有5 g碎牡蠣肉、碎蝦肉、碎鲇魚(yú)肉及魚(yú)鰓和魚(yú)腸的三角瓶中,增菌10 h后進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)。結(jié)果4種樣品都擴(kuò)增出了特異性條帶(圖6),試驗(yàn)證明該雙重PCR對(duì)海產(chǎn)品中存在的副溶血性弧菌有很好的特異性。同時(shí)發(fā)現(xiàn),4種樣品特異性擴(kuò)增條帶亮度不一樣,碎魚(yú)肉的擴(kuò)增條帶亮度最亮??赡苁遣煌.a(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分不同,供細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境也不相同,使含相同菌量的海產(chǎn)品在相同的增菌時(shí)間內(nèi)獲得的菌體數(shù)不同。

    圖6 海產(chǎn)品中雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

    2.6 人工污染靈敏度分析

    不同菌濃度的副溶血性弧菌污染黃花魚(yú)肉后,增菌10 h,雙重PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。PCR條帶亮度隨著污染用菌濃度的減小而減弱,在1.0×103CFU/mL時(shí),擴(kuò)增出450 bp和300 bp的目的片段,而小于該菌濃度時(shí),只有450 bp的目的片段且其亮度逐漸減弱至沒(méi)有。因此,人工污染試驗(yàn)中檢測(cè)攜帶trh毒力基因副溶血性弧菌的靈敏度為1.0×103CFU/mL,即黃花魚(yú)肉中攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌含量為100 CFU/g時(shí),增菌10 h該檢驗(yàn)方法可檢出。

    圖7 人工污染黃花魚(yú)肉中雙重PCR靈敏度分析

    3 結(jié)論

    目的基因的選擇對(duì)于多重PCR檢測(cè)技術(shù)的特異性尤為重要,關(guān)于副溶血性弧菌目的基因的選擇,很多研究報(bào)道采用了不同的基因。強(qiáng)世龍等[5]與岳友宏等[2]采用tlh與tdh基因進(jìn)行雙重PCR檢測(cè),林佳琪等[6]采用tlh、tdh、tox R、trh基因進(jìn)行四重PCR檢測(cè)。tlh基因作為其種屬鑒定基因是所有副溶血性弧菌都攜帶的,trh基因可用于其trh毒性的鑒定。除了trh基因外,副溶血性弧菌的溶血毒素還包括耐熱性溶血毒素(TDH),也是副溶血性弧菌的主要致病因子,在臨床腹瀉患者分離的副溶血性弧菌菌株中90%以上攜帶tdh和(或)trh基因。但trh基因在其他弧菌中有交叉現(xiàn)象,與其他弧菌存在約93%~96%的同源性[7],同時(shí)在副溶血性弧菌神奈川試驗(yàn)為陰性時(shí)也含有致病基因trh[5],因此本試驗(yàn)采用trh基因與種特異性基因tlh設(shè)計(jì)引物進(jìn)行雙重PCR的擴(kuò)增。

    在雙重PCR試驗(yàn)過(guò)程中,任何一個(gè)條件不符合,都很容易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物或者擴(kuò)增失敗。退火溫度是影響PCR反應(yīng)特異性的重要因素之一,較低的退火溫度會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度增高,增大引物與模板錯(cuò)配機(jī)會(huì),出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,造成涂抹帶或者片狀帶。較高的退火溫度,會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度降低,可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果[4]。同時(shí),引物濃度對(duì)雙重PCR擴(kuò)增也有較大的影響,PCR反應(yīng)中,引物一般最適濃度為0.1~1.0 mol/L[8]。過(guò)低的引物濃度會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)法完成30個(gè)循環(huán),使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低;過(guò)高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,在電泳結(jié)果中出現(xiàn)雜帶[4]。針對(duì)這些情況,本研究通過(guò)多次試驗(yàn)確定退火溫度為55 ℃,tlh引物濃度為1.875~14.000 μmol/L,trh引物濃度為14.000 μmol/L,比一般的單重PCR所用引物濃度要低。試驗(yàn)中沒(méi)有形成大量的引物二聚體,擴(kuò)增效果極好,建立了穩(wěn)定的雙重PCR反應(yīng)體系。

    本研究人工污染靈敏度為1.0×103CFU/mL,與純菌菌液靈敏度相比要高,分析原因可能是黃花魚(yú)肉的主要成分蛋白大大促進(jìn)副溶血性弧菌的生長(zhǎng)。通過(guò)計(jì)算,此雙重PCR檢測(cè)污染黃花魚(yú)肉樣品檢出限為100 CFU/g,比強(qiáng)世龍[5]報(bào)道的雙重PCR檢測(cè)模擬污染紅螺樣品檢出限10 CFU/g要低一個(gè)數(shù)量級(jí)。

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