骨關(guān)節(jié)炎與糖尿病的共同疾病基因及其相關(guān)微小RNA的篩選與鑒定▲

袁長深 官巖兵 容偉明 李 哲 梅其杰 延偉偉 段 戡

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨三科，南寧市 530023，電子郵箱：yuanchangshen0920@126.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530000)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見且難以逆轉(zhuǎn)的慢性退行性疾病，可導(dǎo)致患者疼痛、行走不便甚至殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率已達(dá)15%，且與日俱增，預(yù)計(jì)未來10年這一比例將上升為35%[1]。糖尿病是一種較為普遍的慢性疾病，其長期存在的胰島β細(xì)胞功能異常是胰腺癌發(fā)生的重要誘因，并給患者本身及社會帶來了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。全世界范圍內(nèi)，已有4億以上的人口受糖尿病困擾，且人數(shù)逐年遞增，預(yù)估到2040年將高達(dá)6.5億[2]。近年來，骨關(guān)節(jié)炎與糖尿病合并發(fā)病的情況較為多見。流行病學(xué)研究顯示，糖尿病患者中骨關(guān)節(jié)炎的患病率和骨關(guān)節(jié)炎患者中糖尿病的患病率分別為29.5%和14.4%，糖尿病患者的骨關(guān)節(jié)炎總體風(fēng)險(xiǎn)為1.46，骨關(guān)節(jié)炎患者的糖尿病總體風(fēng)險(xiǎn)也達(dá)1.41[3]。不少研究人員表示兩者之間關(guān)系密切，甚至提出了糖尿病性骨關(guān)節(jié)炎的概念[4-6]。然而，也有部分學(xué)者對此持否認(rèn)態(tài)度，認(rèn)為二者并不存有相關(guān)性[7]。因此，明確兩者的潛在聯(lián)系，對骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病的防治具有重要意義。

生物信息學(xué)是一門基于電子信息技術(shù)對生物醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)行相關(guān)研究的交叉性學(xué)科，可從基因分子的角度尋找疾病之間的潛在規(guī)律。因此，本研究基于生物信息學(xué)對骨關(guān)節(jié)炎與糖尿病的共同疾病基因及相關(guān)微小RNA(microRNA,miRNA)進(jìn)行篩選鑒定與分析，為防治二者合并發(fā)病、減少糖尿病性骨關(guān)節(jié)炎患者提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 疾病相關(guān)基因的篩選 在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中分別以“osteoarthritis”“diabetes mellitus”為檢索詞，篩選出與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)集GSE55235及糖尿病相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)集GSE29221。然后，通過GEO2R在線分析系統(tǒng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，對GSE55235中的10例對照組與10例骨關(guān)節(jié)炎組、GSE29221中的12例對照組與12例糖尿病組進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，并下載系統(tǒng)生成的后綴名為“csv”格式文件，將后綴名改為“xls”格式，以Excel表格形式打開并刪除重復(fù)項(xiàng)與空缺值，最后再以同時(shí)滿足P≤0.05和|log2FC|≥1為篩選條件，篩選出骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病的差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG)。

1.2 篩選共同疾病基因 通過R軟件包“VennDiagram”對骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病相關(guān)DGE進(jìn)行分析并取交集，建立韋恩圖，以獲得共同疾病基因。

1.3 共同疾病基因的富集分析 將得到的共同疾病基因輸入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，保存結(jié)果并進(jìn)行可視化輸出。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的創(chuàng)建及關(guān)鍵基因的篩選 在STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中，以綜合評分≥0.4為限制條件，創(chuàng)建共同疾病基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),然后進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，并采用Cytoscape軟件所附帶的“cytoHubba”插件中的Closeness、Degree、Bottleneck及MNC等4種不同計(jì)算方法分別挖掘出得分最高的前10位基因，取交集后獲得Hub基因。

1.5 Hub基因相關(guān)miRNA的預(yù)測 將Hub基因依次導(dǎo)入miRNet(https://www.mirnet.ca/)數(shù)據(jù)庫內(nèi)獲得Hub基因相關(guān)miRNA，然后可視化呈現(xiàn)Hub基因及相關(guān)miRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，并篩選出與4個(gè)Hub基因的相關(guān)性程度綜合排名位列前5的關(guān)鍵miRNA。

2 結(jié) 果

2.1 骨關(guān)節(jié)炎和糖尿病的共同疾病基因 對骨關(guān)節(jié)炎基因芯片GSE55235及糖尿病基因芯片GSE29221進(jìn)行分析，得到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)DEG共1443個(gè)(上調(diào)基因525個(gè)，下調(diào)基因920個(gè))，糖尿病相關(guān)DEG共1 176個(gè)(上調(diào)基因919個(gè)，下調(diào)基因257個(gè))，見圖1。利用R語言軟件包“VennDiagram”將獲得的二者相關(guān)DEG取交集，共獲得148個(gè)共同疾病基因，見圖2。

圖1 骨關(guān)節(jié)炎和糖尿病相關(guān)DGE的篩選結(jié)果

圖2 Venn圖

2.2 GO和KEGG富集分析結(jié)果 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共同疾病基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)其在GO富集分析的生物過程模塊中主要富集在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)組織、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)刺激的細(xì)胞反應(yīng)等;在細(xì)胞成分模塊中主要富集在ECM、膠原三聚體、蛋白細(xì)胞外基質(zhì)等；在分子功能模塊中主要富集在肝素結(jié)合、血小板衍生生長因子結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活性等。在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)其主要富集在磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號通路中。見圖3及圖4。

圖3 GO富集分析結(jié)果

圖4 KEGG富集分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選結(jié)果 采用STRING數(shù)據(jù)庫建立共同疾病基因的PPI網(wǎng)絡(luò)后，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾⒗?種不同計(jì)算方法分別篩選出得分前10位的基因，進(jìn)行交集后得到4個(gè)Hub基因：CD44、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)、C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5,CCL5)及Ⅰ型膠原α2鏈(collagen type Ⅰ alpha 2 chain，COL1A2)。見表1和圖5。

表1 4個(gè)Hub基因在4種不同算法的得分(分)

圖5 4種算法篩選得到基因的交集圖

2.4 4個(gè)Hub基因相關(guān)miRNA的預(yù)測 通過miRNet數(shù)據(jù)庫預(yù)測4個(gè)Hub基因的相關(guān)miRNA，共發(fā)現(xiàn)359個(gè)有關(guān)的miRNA，篩選出綜合排名位列前5的關(guān)鍵miRNA，分別為miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p、miRNA-29c-3p，見表2及圖6。

表2 5個(gè)關(guān)鍵miRNA的信息

圖6 Hub基因與上游miRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

3 討 論

臨床上骨關(guān)節(jié)炎與糖尿病合并發(fā)病并不少見，但二者的相關(guān)性仍存有爭議[8]。因此，本研究從生物分子學(xué)層面挖掘出骨關(guān)節(jié)炎與糖尿病的共同發(fā)病基因及其相關(guān)miRNA，以明確二者的潛在聯(lián)系，從而預(yù)防糖尿病性骨關(guān)節(jié)炎。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫及GEO2R的在線分析工具共得到148個(gè)可同時(shí)存在于骨關(guān)節(jié)炎與糖尿病中的共同疾病基因，經(jīng)GO及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這些共同疾病基因主要富集在TNF、ECM、FGF等相關(guān)生物功能及PI3K/Akt與MAPK等信號通路中。(1)TNF與骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病的關(guān)系：TNF-α作為TNF家族中重要組成部分，可間接參與骨關(guān)節(jié)炎的調(diào)控，其介導(dǎo)的白細(xì)胞介素34表達(dá)水平與膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9]；而在1型糖尿病中，高表達(dá)狀態(tài)的TNF-α往往預(yù)示著血糖的控制情況并不理想[10]。(2)ECM與骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病的關(guān)系：對2型糖尿病而言，脂肪細(xì)胞代謝障礙是其發(fā)病的重要誘因，而ECM又是損害脂肪細(xì)胞部分代謝功能的關(guān)鍵因素[11]；對骨關(guān)節(jié)炎而言，ECM合成與降解的失衡狀態(tài)可造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞，并可作為判斷其發(fā)生的重要標(biāo)志[12]。(3)FGF與骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病的關(guān)系：FGF的不同亞族在骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病中可發(fā)揮不同的調(diào)控作用。例如，在骨關(guān)節(jié)炎中，F(xiàn)GF18可增加膠原Ⅱ的沉積并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)而減輕軟骨的降解[13]；在糖尿病中，F(xiàn)GF21可降低血糖及改善代謝狀況，并能減輕各種相關(guān)并發(fā)癥的損傷[14]。(4)PI3K/Akt、MAPK信號通路與骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病的關(guān)系：抑制PI3K/Akt傳導(dǎo)途徑能有效改善骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨的變性[15]，但會誘發(fā)胰島素抵抗而引發(fā)2型糖尿病[16]。p38-MAPK通路作為MAPK通路的關(guān)鍵成員，抑制該通路可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[17]，同時(shí)可抑制活性氧的產(chǎn)生及炎性介質(zhì)的釋放，從而通過調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)來顯著延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[18]。

本研究進(jìn)一步對PPI網(wǎng)絡(luò)通過拓?fù)浞治?，并利?種不同計(jì)算方法分別篩選出得分前10位的基因，再進(jìn)行交集獲得4個(gè)Hub基因，即CD44、IGF1、CCL5及COL1A2。CD44不僅可以破壞軟骨細(xì)胞與ECM的相互作用關(guān)系，在膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中呈高表達(dá)水平[19]，而且還可以導(dǎo)致胰島素抵抗，其表達(dá)水平在糖尿病患者的血漿中上調(diào)[20]。IGF1是維持軟骨平衡狀態(tài)的重要因素，有望成為骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)[21]；其還與糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)呈U形關(guān)聯(lián)，即較低或較高的IGF1水平能明顯增加糖尿病的患病概率[22]。CCL5不僅可以誘導(dǎo)多種基質(zhì)金屬蛋白酶及一氧化氮合酶的表達(dá)，從而引起骨關(guān)節(jié)炎中軟骨ECM的降解[23]，而且還是1型糖尿病等免疫相關(guān)性疾病發(fā)病的重要因素,同時(shí)其表達(dá)水平的上調(diào)可能是1型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)[24]。由此可見，CD44、IGF1及CCL5在骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病中的重要調(diào)控作用，但目前尚未見有研究報(bào)告COL1A2同時(shí)在二者中發(fā)揮作用。

最后，通過對4個(gè)Hub基因進(jìn)行相關(guān)miRNA預(yù)測，獲得排名前5的miRNA：miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p、miRNA-29c-3p。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p與miRNA-34a-5p在骨關(guān)節(jié)炎中分別起著不同的調(diào)控作用；然而在糖尿病中，卻尚未發(fā)現(xiàn)上述miRNA能直接參與血糖的調(diào)控機(jī)制，但在糖尿病腎病中卻扮演著重要的角色。(1)miRNA-26a-5p：促進(jìn)miRNA-26a-5p的表達(dá)會抑制陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白樣蛋白1/核因子κB通路，以防止腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并延緩糖尿病腎病的發(fā)展[25]；在骨關(guān)節(jié)炎中，來源于人骨間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體中的miRNA-26a-5p過表達(dá)會下調(diào)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2的表達(dá)，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[26]。(2)miRNA-27a-3p：研究表明，F(xiàn)OXD2-AS1的過表達(dá)會誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)及軟骨ECM出現(xiàn)降解，但miRNA-27a-3p可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象[27]；而在調(diào)控糖尿病腎病方面，miRNA-27a-3p則會引起腎纖維化、線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來參與糖尿病腎病的發(fā)生[28]。(3)miRNA-98-5p：miRNA-98-5p不僅能通過靶向調(diào)控高遷移率族蛋白A2減輕上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化進(jìn)而延緩糖尿病腎病的進(jìn)程[29]，而且其表達(dá)量的減少亦是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的重要因素[30]。(4)miRNA-34a-5p：miRNA-34a-5p能抑制在腎間質(zhì)纖維化演變中起重要作用的沉默信息調(diào)節(jié)因子1的表達(dá)，作為糖尿病腎病治療的新靶點(diǎn)[31]；此外其在骨關(guān)節(jié)炎中呈高表達(dá)狀態(tài)而破壞關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)[32]。但是miRNA-29c-3p在骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病中的調(diào)控作用，目前尚未見有相關(guān)研究報(bào)告。

綜上所述，CD44、IGF1、CCL5及其對應(yīng)的miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p同時(shí)在骨關(guān)節(jié)炎及糖尿病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。由此可見，骨關(guān)節(jié)炎和糖尿病之間存在潛在聯(lián)系，這或可為今后防治糖尿病性骨關(guān)節(jié)炎提供一定的理論基礎(chǔ)。但本研究方法也有不少不足之處，例如選取的基因芯片包含的樣本數(shù)量不夠大，以及只是單純在理論層次上進(jìn)行研究，而缺乏相關(guān)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以佐證等。