硫化氫對骨與關(guān)節(jié)保護(hù)作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張博文，閆景龍

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院脊柱外科，黑龍江 哈爾濱 150086)

硫化氫(H2S)是一種無色、具有典型臭雞蛋氣味的有毒氣體[1]。近幾十年來，許多文獻(xiàn)已經(jīng)報道H2S存在于生物系統(tǒng)中并具有多種生物學(xué)功能，其中最主要的功能是維持生理穩(wěn)態(tài)。它和一氧化氮、一氧化碳一樣是組織系統(tǒng)中內(nèi)源性釋放的氣體遞質(zhì)[1]，在大腦、心臟、腎臟、胃腸道、骨骼肌和骨骼中產(chǎn)生[2]。在哺乳動物組織中，H2S主要在同型半胱氨酸代謝的轉(zhuǎn)硫途徑中內(nèi)源產(chǎn)生，其中胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)是生成H2S的兩種關(guān)鍵酶[2]。H2S不僅僅是這一途徑的二次反應(yīng)產(chǎn)物，而且是調(diào)節(jié)多種組織生理功能的重要因子。

H2S的合成和分布取決于組織特異性，CBS主要在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)、中樞神經(jīng)、回腸、腎臟及胰島中表達(dá)，CSE主要在心臟、腎臟、血管內(nèi)皮和血管平滑肌中大量表達(dá)[3]。有報道指出，H2S通過調(diào)控BMSCs的表觀遺傳分化來維持骨骼合成代謝及穩(wěn)態(tài)[3-4]，這表明了H2S對骨的保護(hù)作用。還有研究表明H2S是免疫系統(tǒng)中維持T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要介體[5-6]，它不僅可以起到抗氧化、抗炎，還具有平衡氧化還原和誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)的作用[5，7]，表明了H2S能夠抗炎癥性關(guān)節(jié)炎，體現(xiàn)了其對關(guān)節(jié)的保護(hù)作用。本文綜述了H2S對骨骼及關(guān)節(jié)的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

1 H2S通過抑制JNK-p-DNMT1通路抵抗高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失

H2S作為一種內(nèi)源性氣體遞質(zhì)，具有抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡的作用，與骨骼發(fā)育密切相關(guān)。H2S的生理和病理作用的相關(guān)研究清楚地解釋了H2S在骨骼疾病中的骨保護(hù)作用[1，3-4]。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨吸收和骨形成(破骨和成骨)失衡為特征的骨骼疾病。甲硫氨酸的過量攝入往往會導(dǎo)致骨骼脆弱而增加骨折的風(fēng)險[8]。甲硫氨酸代謝途徑的紊亂會導(dǎo)致血清同型半胱氨酸升高，引起HHcy，它是一種涉及CBS的常染色體隱性疾病[8]。研究表明，H2S在逆轉(zhuǎn)HHcy誘導(dǎo)的骨丟失中有重要作用[9]。實驗人員以高甲硫氨酸飲食喂養(yǎng)小鼠，降低內(nèi)源性H2S產(chǎn)生，誘發(fā)小鼠產(chǎn)生HHcy，HHcy激活C-Jun/JNK-p通路并進(jìn)一步調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)的表達(dá)，DNMT1升高會導(dǎo)致破骨細(xì)胞抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG)啟動子過度甲基化，從而導(dǎo)致BMSCs分化的成骨細(xì)胞功能障礙，并且HHcy使核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-kappa Bligand，RANKL)上調(diào)，增加了破骨細(xì)胞生成和骨質(zhì)流失[9]。使用硫氫化鈉(H2S供體)能夠抑制JNK-p-DNMT1通路，使DNMT1表達(dá)減少，進(jìn)而上調(diào)OPG，從而增加成骨，這顯示了H2S的骨保護(hù)特性[9](見圖1)。還有研究表明，HHcy可誘導(dǎo)蛋白磷酸酶2A磷酸化，進(jìn)而下調(diào)p38 MAPK和叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead transcription factor 1，F(xiàn)OXO1)的表達(dá)，從而抑制OPG的合成，實驗中給予N-乙酰半胱氨酸可以提高骨骼中FOXO1和OPG的水平，從而逆轉(zhuǎn)HHcy介導(dǎo)的骨丟失[10]。調(diào)節(jié)H2S的代謝或使用H2S供體能夠在治療HHcy引起的骨質(zhì)疏松方面發(fā)揮重要作用。

2 H2S通過維持組蛋白去乙?；?(histone deacetylase-3，HDAC3)活性抵抗CBS缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)流失

CBS表達(dá)水平在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中升高，并發(fā)揮重要作用，由它介導(dǎo)生成的H2S可以維持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化[11]。實驗數(shù)據(jù)表明，缺乏CBS小鼠的血清和細(xì)胞內(nèi)H2S水平降低，使其血漿中的同型半胱氨酸水平升高，這會導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化損傷和功能障礙，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松[11]。有研究表明，H2S缺乏會通過增強(qiáng)氧化損傷來抑制HDAC3的活性，使染色質(zhì)的組蛋白(H3K27ac)上的乙?；嚢彼釟埢c啟動子結(jié)合，進(jìn)一步降低Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)的成骨作用，同時轉(zhuǎn)錄激活炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)[5，12]。并且研究發(fā)現(xiàn)BMSCs分泌的IL-6可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和骨吸收[12]。因此，H2S缺乏會減弱成骨作用，增強(qiáng)破骨作用。在缺乏CBS的小鼠中使用H2S能夠通過恢復(fù)BMSCs中的HDAC3活性來減弱組蛋白乙酰化依賴性炎癥，從而促進(jìn)RUNX2介導(dǎo)的骨形成[12](見圖2)。總體而言，恢復(fù)血漿中的H2S水平可能是治療CBS缺乏引起代謝性骨質(zhì)疏松癥的一種新方法。

圖1 H2S通過抑制JNK-p-DNMT1通路抵抗HHcy導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失示意圖

圖2 H2S通過維持HDAC3活性抵抗CBS缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)流失示意圖

3 H2S通過調(diào)控Ca2+瞬態(tài)受體電位通道維持骨穩(wěn)態(tài)

機(jī)制研究表明，BMSCs中H2S在生理水平上對維持細(xì)胞鈣通道的正常功能起著關(guān)鍵作用。H2S缺乏使多個Ca2+瞬態(tài)受體電位通道上半胱氨酸殘基的蛋白巰基化減少而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流減少，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+流量水平降低進(jìn)一步抑制了蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)依賴的信號通路，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化減弱，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松[11]。通過使用硫氫化鈉或GYY4137(H2S供體)使體內(nèi)H2S濃度達(dá)到生理水平，從而在通道蛋白硫基化過程中，反應(yīng)性半胱氨酸的巰基被修飾為-SSH基團(tuán)，提高了半胱氨酸殘基的反應(yīng)性，進(jìn)而使BMSCs可以發(fā)生正常的級聯(lián)反應(yīng)，最終恢復(fù)正常的骨穩(wěn)態(tài)[11](見圖3)?？偟膩碚f，生理水平的H2S能夠確保BMSCs上Ca2+瞬態(tài)受體電位通道的正常功能，以維持機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)。

圖3 H2S通過調(diào)控Ca2+瞬態(tài)受體電位通道維持骨穩(wěn)態(tài)示意圖

4 H2S能夠抵抗雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)流失

雌激素由于具有抗氧化的活性和平衡體內(nèi)磷酸鈣并維持骨代謝的作用，可以預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[8，13]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種常見的骨骼疾病，由于絕經(jīng)后雌激素水平下降，使破骨細(xì)胞成熟而增加了骨吸收過程，最終導(dǎo)致骨小梁和皮質(zhì)骨進(jìn)一步改變，使骨質(zhì)流失增加骨折風(fēng)險[8，13]。有研究表明，遺傳因素對于確定雌激素缺乏后小鼠的骨質(zhì)流失程度很重要，此報道提出更年期期間和之后的骨丟失可能是由部分遺傳因素調(diào)控的[13]。但是，仍然需要進(jìn)一步地研究遺傳因素控制由雌激素缺乏引起骨骼變化的機(jī)制。有研究以去卵巢大鼠為研究對象，探討了H2S在機(jī)體缺乏雌激素的病理環(huán)境下的骨保護(hù)作用[14]。實驗人員通過卵巢切除術(shù)(oophorectomy，OVX)增加破骨細(xì)胞的形成來增強(qiáng)骨吸收，用以模擬雌激素缺乏的病理狀態(tài)[14]。通過使用GYY4137緩慢釋放H2S，最終使血漿H2S水平趨于正?；軌蚍乐股踔聊孓D(zhuǎn)OVX引起的骨小梁和骨皮質(zhì)改變的結(jié)果[14]。實驗證明，使用H2S可以逆轉(zhuǎn)由雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松，增加骨骼的最大應(yīng)力，減少骨質(zhì)疏松及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[14]。實驗中使用GYY4137很好地模擬了內(nèi)源性神經(jīng)內(nèi)分泌氣體信號分子H2S的骨保護(hù)作用，然而不足的是，他們沒有在臨床上探索GYY4137的治療效果，所以在人體上的治療結(jié)果可能會有所不同，并且GYY4137作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?？傮w而言，恢復(fù)血漿H2S水平可能是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一種方法，為今后研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療靶點指明了方向。

5 H2S有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的作用

H2S的作用與其他生長因子相似，能夠通過促進(jìn)骨折處干細(xì)胞的增殖和分化來啟動修復(fù)過程[15]。研究報道指出在小鼠下頜骨缺損模型中，使用GYY4137可以促進(jìn)骨折愈合[15]。此外，給予外源性H2S可以治療由模擬微重力和牽張成骨等引起的骨丟失[16]。在小鼠牽張成骨模型中，給予H2S可以加速骨小梁成熟微結(jié)構(gòu)的形成和礦化，取代纖維結(jié)締組織，并改善骨痂在牽張間隙內(nèi)愈合的力學(xué)性能[16]。機(jī)制研究表明，CSE是成骨細(xì)胞中主要表達(dá)促進(jìn)H2S產(chǎn)生的酶，CSE-H2S系統(tǒng)作為一種新的反式激活調(diào)節(jié)劑通過使RUNX2巰基化促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，從而促進(jìn)骨愈合[15]。已有報道提出H2S是各種細(xì)胞存活和凋亡的調(diào)節(jié)劑，給予H2S可以預(yù)防多種形式的應(yīng)激(低氧、氧化損傷或血清剝奪)引起的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和存活[3，17-18]。例如，H2S可通過上調(diào)抗凋亡基因B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)來調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，從而減弱缺氧引起的效應(yīng)[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)H2S通過抑制成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)中的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路和激活PI3K/Akt通路來防御氧化應(yīng)激，保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞免受凋亡，起到骨保護(hù)的作用[19]。調(diào)節(jié)H2S代謝或使用H2S供體可能成為骨折的治療方法，然而要使H2S在臨床中直接給藥，還需要更深入的研究和實踐。

6 H2S能夠誘導(dǎo)細(xì)胞遷移

自體內(nèi)皮祖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損部位的募集是誘導(dǎo)骨組織修復(fù)的關(guān)鍵[20]。內(nèi)皮祖細(xì)胞還在動脈損傷后的內(nèi)皮修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力是新生血管和血管再生重要的因素之一[20]。H2S在兩種類型的細(xì)胞中都有誘導(dǎo)遷移的功能，H2S的缺乏減弱了血管損傷后內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員，削弱了它們的黏附和克隆能力，CSE缺乏介導(dǎo)的H2S水平下降導(dǎo)致高糖處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力減弱，給予硫氫化鈉治療恢復(fù)了兩種細(xì)胞的上述能力[21-22]。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)H2S增強(qiáng)了其他類型細(xì)胞的遷移能力，例如給予硫氫化鈉能加速皮膚成纖維細(xì)胞和人類角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)傷口愈合[22]。

7 H2S具有抗氧化和抑制炎性因子的作用

H2S是一種可以限制自由基損傷和炎癥的內(nèi)源性介質(zhì)，是一種能夠與多種氧化應(yīng)激源直接反應(yīng)的強(qiáng)還原劑，在平衡細(xì)胞氧化還原狀態(tài)方面起著重要的作用[23]。此外，H2S能夠?qū)怪|(zhì)過氧化，逆轉(zhuǎn)線粒體功能障礙和增加參與細(xì)胞抗氧化防御的超氧化物歧化酶活性[23-24]。最近已經(jīng)證實內(nèi)源性H2S在不同的炎癥性疾病中的抗氧化和抗炎特性，它能夠抑制淋巴細(xì)胞和天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎介質(zhì)，從而使促炎介質(zhì)和黏附分子的表達(dá)減少[5]。在關(guān)節(jié)炎的早期階段，氧化應(yīng)激是蛋白質(zhì)翻譯后修飾和產(chǎn)生自身反應(yīng)性抗體的原因，在啟動炎癥過程中起著關(guān)鍵作用[25]。促炎癥細(xì)胞因子、生長因子，尤其是血管內(nèi)皮生長因子在滑膜中的放大表達(dá)，增加了失調(diào)的新生血管，導(dǎo)致滑膜缺氧[26]。關(guān)節(jié)炎活動期的特征是血管化、氧化應(yīng)激和滑膜中免疫細(xì)胞浸潤，從而誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)肥大，最終使炎癥持續(xù)，形成慢性循環(huán)，導(dǎo)致軟骨的損傷。這使得FLS、免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子能夠侵入軟骨下骨，形成特征性的骨質(zhì)侵蝕[27]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是破骨細(xì)胞分化和成熟進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的關(guān)鍵因素，而H2S對NF-κB活性的抑制能夠減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[28](見圖4)。研究表明，能夠釋放H2S的化合物誘導(dǎo)了基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，從而逆轉(zhuǎn)IL-1的分解作用[24]。H2S還能下調(diào)FLS中由IL-1誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-14的表達(dá)[24]。此外，H2S還可以抑制炎性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中必不可少的細(xì)胞因子TNF-α的活性[29]。這些研究表明，H2S具有對關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)損傷的保護(hù)作用。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，H2S與非甾體抗炎藥偶聯(lián)可抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟，這表明了H2S與非甾體抗炎藥偶聯(lián)用于治療炎癥性關(guān)節(jié)炎有疊加作用[30]。然而，H2S的關(guān)節(jié)保護(hù)作用并不是劑量依賴性的，有研究表明，在脂多糖刺激的小鼠巨噬細(xì)胞中，低濃度H2S(硫氫化鈉200 μmol/L)可以抑制幾種促炎介質(zhì)(NO、NF-κB、IL-6和IL-1)的合成和激活，而高濃度H2S(硫氫化鈉1 000 μmol/L)卻能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎分子[28]。H2S可以作為一種關(guān)節(jié)炎疾病中的調(diào)節(jié)性保護(hù)藥物，但H2S在臨床應(yīng)用的方案還需要進(jìn)一步的研究。

圖4 關(guān)節(jié)炎中重要的致病炎性因子示意圖

8 小結(jié)與展望

H2S是一種無色、具有典型臭雞蛋氣味的有毒氣體，到目前為止，還沒有解毒劑可用于對抗H2S毒性[1，31]。越來越多的證據(jù)證明，H2S在骨骼系統(tǒng)的生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。已知H2S可以調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，確保骨骼代謝的動態(tài)平衡。在HHcy、去卵巢和骨折動物模型中，H2S對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化、功能調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用，應(yīng)用H2S可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)病理性骨丟失。機(jī)制研究表明，H2S控制著關(guān)鍵的細(xì)胞信號通路、蛋白質(zhì)的巰基化，以及骨骼組織中染色質(zhì)水平的表觀遺傳。此外，H2S具有抗炎和誘導(dǎo)受損關(guān)節(jié)組織修復(fù)作用。因此，未來的研究有必要對H2S在骨與關(guān)節(jié)中的生理和病理作用及其機(jī)制進(jìn)行深入地探索，并努力找到合適的H2S供體以供臨床使用，從而使H2S成為一種治療骨與關(guān)節(jié)疾病成熟有效的藥物。