鍶對磷酸鎂骨水泥理化性質(zhì)及成骨活性影響的研究

邱永龍，施玉博，李威，龔長天，郭衛(wèi)春

(武漢大學人民醫(yī)院骨科，武漢 430060)

骨缺損修復是目前骨科臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)之一[1]。自體骨由于可避免免疫排斥及潛在的傳播疾病風險等一系列問題，而一直被視為臨床上治療骨缺損的“金標準”[2]。然而，自體骨的來源有限且常給患者帶來“二次手術”的痛苦，對于大塊骨缺損常不能很好地解決問題，但作為自體骨替代物之一的同種異體骨通常價格較為昂貴。且有研究發(fā)現(xiàn)，同種異體骨的移植有較大可能產(chǎn)生免疫排斥及傳播疾病，從而產(chǎn)生骨缺損以外的機體損傷[3]。在自體骨和同種異體骨應用受限的情況下，尋找一種力學性質(zhì)穩(wěn)定、生物學性能優(yōu)異的人工骨替代品成為目前眾多學者主要的研究方向之一。

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)骨水泥作為較早投入臨床使用的骨水泥，具有凝固迅速、力學強度高等優(yōu)點；但PMMA骨水泥在凝固過程中放熱劇烈、峰值溫度較高，會對周圍組織造成一定的損傷[4]。同時PMMA骨水泥的生物學性能較差，且單體具有一定的生物毒性[5]。另外，幾乎不降解的PMMA骨水泥長期存在于骨缺損處，極大影響了新生骨的長入而不利于骨組織的修復。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)作為一種與人體骨成分類似的人工骨替代品，其生物學性能、降解性、力學性質(zhì)及凝固速度可以通過添加物進行有效地改善[6-7]，但是它的初始力學性能差、降解緩慢及成骨活性差等一些劣勢極大的限制了它的臨床應用及推廣。

由于PMMA骨水泥和CPC均存在一定的缺陷，具有明顯優(yōu)勢的磷酸鎂骨水泥(magnesium phosphate cements，MPC)成為目前骨修復材料領域研究的新方向。MPC在具有優(yōu)良的力學性能的同時，兼具更為突出的生物學性能和降解性能[8]。具體體現(xiàn)在MPC能夠促進成骨細胞等細胞在材料表面黏附增殖。此外，MPC的降解性能優(yōu)于PMMA骨水泥和CPC，可以在更短的時間內(nèi)降解，以解除人工骨替代品的占位，更有利于血管長入和新骨生成[9]。但MPC作為一種新型骨修復材料，其生物學性能的研究尚不完全，且單一MPC的成骨活性常難以滿足目前臨床上的要求。目前針對MPC不足之處的主要改進方法有改善煅燒工藝，以及通過添加一種或多種具有一定良好性質(zhì)的無機物或者有機物等。

鍶(Sr)作為一種廣泛存在于人體各個部位組織中的微量元素，其生理功能與骨骼形成密切相關[10]。Sr具有促進前成骨細胞增殖、骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化、骨基質(zhì)礦化以及抑制破骨細胞分化等作用[11]。目前已有眾多研究證實，Sr可以通過下調(diào)Wnt抑制劑硬骨素的表達，進一步增強下游β-Catenin信號的轉(zhuǎn)導；使細胞內(nèi)促成骨因子表達增多，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白和骨鈣素等高表達，進而促進成骨細胞成熟分化及促進骨形成[12]。因此，為了進一步改進MPC的成骨能力，本研究考慮通過添加Sr對MPC進行改性，研究Sr-MPC性質(zhì)的改良及其對動物模型骨缺損修復的影響，以期制備一種性能更加優(yōu)越的新型骨修復材料。

1 材料與方法

1.1 摻鍶MPC的制備方法 Sr-MPC的固相由磷酸二氫鉀、重燒后的氧化鎂和氧化鍶組成，其中磷酸二氫鉀與氧化鎂的摩爾比為1︰1.5。采用球磨機對固相中各成分分別進行研磨，通過200目篩篩分，得到粒徑約75 μm的顆粒。氧化鍶按照占固相質(zhì)量百分數(shù)分別添加2%、4%、6%和8%，將混合后的固相粉末按照2 g/mL的固液比與去離子水充分混合，攪拌成均勻的膏體，分別灌注到直徑6 mm、高度12mm的圓柱形模具進行物化性能測試和直徑6 mm、厚度1 mm的圓盤模具進行生物性能測試。所有樣品在37℃和100%相對濕度的烘箱中烘烤72 h，硬化后在121℃和1.21 MPa的濕熱條件下滅菌30 min。MPC作為對照。具體制備比例及命名見表1。

表1 磷酸鎂骨水泥及鍶/磷酸鎂復合骨水泥的配方

1.2 凝固時間、放熱溫度、力學強度和體外降解率 根據(jù)中國國家標準，凝固時間的定義為維卡儀針頭無法穿透樣品1 mm時所花費的時間。放熱溫度使用溫度傳感器測量，溫度傳感器放置在水泥膏體中間，并將膏體置于聚苯乙烯模具中保溫。樣品的抗壓強度按照英國標準局提出的標準，在加載速率為1 mm/min時，采用通用試驗機進行測量。體外降解率測量方法為將樣品浸泡于生理鹽水之中，生理鹽水與樣品的比例為2 mL/g，樣本在第1天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天和第28天分別清洗、烘干，減重率按烘干后重量占初始重量的百分比計算。每組3個獨立樣本，取結(jié)果均值。

1.3 材料表面形貌和細胞電鏡 采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察骨水泥樣品表面的形貌和細胞形態(tài)。骨水泥材料烘箱干燥后噴金，在SEM下觀察材料表面形貌。細胞電鏡則需要骨水泥材料與MC3T3-E1成骨前細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗材料3遍，在4%多聚甲醛溶液中固定15 min，梯度脫水，烘箱干燥后噴金，在SEM下觀察材料表面細胞形態(tài)。

1.4 細胞增殖 MC3T3-E1成骨前細胞用于評估不同材料樣品上的細胞增殖情況。細胞培養(yǎng)于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基配方為90% α-MEM，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。所有樣品滅菌后置于6孔板中，在細胞種植前用培養(yǎng)基預培養(yǎng)。然后以1×104的密度將細胞接種于所有樣品表面，培養(yǎng)1、3、5 d，每3天更換新鮮培養(yǎng)基。在指定時間點，每孔加100 μL PBS沖洗，重復3次。每孔加入10 μL細胞計數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)溶液，37℃孵育2 h。最后將100 μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到96孔板上，在450 nm處用酶標儀測定光密度(optical density，OD)。

1.5 ALP活性測定 用對硝基苯基磷酸鹽(p-nitrophenyl phosphate，pNPP)測定ALP活性。將樣品置于6孔板，種植MC3T3-E1細胞。細胞孵育7 d、14 d后，PBS洗滌2次，用裂解緩沖液裂解，隨后將樣品液轉(zhuǎn)移至96孔板中，再加入pNPP底物溶液。樣品在室溫黑暗中孵育30 min，用酶標儀在405 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算不同樣品中的ALP活性。

1.6 成骨相關基因表達測定 采用實時定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測成骨相關基因的表達情況。具體方法為，用TRIzol法提取總RNA，用RevertAidTM第一鏈互補DNA(complementary DNA，cDNA)合成試劑盒合成cDNA。采用ABI PRISM 7900HT快速序列檢測系統(tǒng)進行實時PCR檢測。骨形成相關基因，包括骨鈣素(osteocalcin，OC)和Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)的表達采用2-ΔΔCt方法歸一化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。引物序列見表2。

表2 PCR實驗中的引物序列

1.7 動物實驗 動物實驗經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院臨床倫理審查委員會審核通過?；谇捌趯Σ牧侠砘再|(zhì)的測定及細胞實驗結(jié)果，認為Sr-MPC-8組最為優(yōu)異，故選擇Sr-MPC-8組作為實驗組進行動物實驗，MPC組作為對照組。將10只Sprague-Dawley大鼠隨機分為兩組：MPC組和Sr-MPC-8組，每組5只。通過腹腔注射50 mg/kg 氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪混合物麻醉大鼠。麻醉成功后，剃光頭部被毛并用碘伏消毒。沿正中線矢狀切開3 cm，分離軟組織和骨膜，顯露雙側(cè)頂骨、部分枕骨和額骨。然后，使用牙鉆在雙側(cè)頂骨創(chuàng)建2個全厚度骨缺損(直徑6mm)，將MPC和Sr-MPC-8樣本放入缺損處后，用可吸收縫合線縫合骨膜組織和皮膚。大鼠飼養(yǎng)1個月后處死，取頂骨分析，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。切片機切割組織切片(10 μm)，進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

2 結(jié) 果

2.1 凝固時間和放熱溫度 圖1a可見，與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，Sr-MPC的凝固時間有所延長，但Sr-MPC-2、Sr-MPC-4、Sr-MPC-6三組之間未見明顯的差異，Sr-MPC-8組較MPC組凝固時間延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。認為氧化鍶的添加比例對于骨水泥的凝固時間有一定的影響，8%氧化鍶的加入一定程度上延長了新型骨水泥的凝固時間，這可能與氧化鍶的加入延緩了氧化鎂的溶解有關，一定程度上延緩了MPC的水和反應。圖1b可見，與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，骨水泥材料的放熱溫度呈現(xiàn)上升趨勢，與Sr-MPC-4、Sr-MPC-6、Sr-MPC-8三組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果提示這可能與氧化鍶的添加比例有關，氧化鍶的添加比例為2%時，對本身MPC的水和反應放熱影響不大，其差異并無統(tǒng)計學意義。但當添加比例進一步上升，添加比例達到4%、6%和8%時，考慮氧化鍶與液相去離子水反應產(chǎn)生堿性的氫氧化鍶，本質(zhì)上也參與了酸堿中和反應，因此也會放出一定的熱量，這使得骨水泥材料的放熱溫度有所上升。但總體來看，溫度上升的幅度并不大。

a 凝固時間 b 放熱溫度

2.2 力學強度與體外降解率 圖2a可見，與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，骨水泥材料的力學強度呈現(xiàn)上升趨勢，與Sr-MPC-4、Sr-MPC-6、Sr-MPC-8三組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與第3天和第5天時Sr-MPC-2組比較，差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果可見骨水泥材料的強度會受到添加物比例的影響，力學強度的上升可能與添加物影響了MPC自身的水和反應有關，氧化鍶的加入影響了氧化鎂與磷酸二氫鹽的水和反應，影響了KMgPO4·6H2O晶體的生成，鍶可能參與了KMgPO4·6H2O晶體裂隙的填補與部分替換，使得晶體排列更為致密，因此對材料的力學強度產(chǎn)生了一定的影響。圖2b可見，與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，骨水泥材料的體外降解率呈現(xiàn)下降趨勢，其中Sr-MPC-8的體外降解率有明顯的降低，這可能與氧化鍶的加入提高了材料的力學強度有關，鍶元素的填補使得晶體排列更為致密，一定程度上延緩了Sr-MPC的體外降解。

a 力學強度 b 體外降解率

2.3 材料表面形貌 與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，電鏡下骨水泥材料的表面形貌表現(xiàn)出一定的差異，具體表現(xiàn)為Sr-MPC表面顆粒感更加顯著。MPC組電鏡下可見較多裂痕，晶體排列較為疏松，而Sr-MPC表面則表現(xiàn)為顆粒狀的細小晶體，排列較為致密，考慮為氧化鍶的添加影響了KMgPO4·6H2O晶體的生成，鍶元素填補了KMgPO4·6H2O晶體之間的裂隙，使微觀結(jié)構(gòu)變得致密，因此對材料的表面形貌產(chǎn)生了一定的影響(見圖3)。

圖3 各組掃描電鏡下材料的表面形貌

2.4 細胞增殖 由圖4可見，與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，添加氧化鍶的骨水泥組其OD值表現(xiàn)為上升趨勢，第1天Sr-MPC-8組與MPC組有具有統(tǒng)計學意義的差異(P<0.05)，而第3天和第5天時，各組與MPC組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？梢娧趸J的加入，對于成骨細胞的增殖有較為明顯的促進作用，且隨著氧化鍶比例的增加，這種促進作用也在隨之增加，Sr-MPC-8組表現(xiàn)最為顯著。

2.5 ALP活性測定 與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，添加氧化鍶的骨水泥組其ALP的活性有較為顯著的上升，且各組之間差異明顯。ALP作為成骨細胞的表型標志物之一，可以直接反映成骨細胞的活性及功能狀況。實驗結(jié)果表明，隨著氧化鍶添加比例的上升，與材料共培養(yǎng)的成骨細胞其ALP活性越高，以Sr-MPC-8組最為顯著。這進一步表明，鍶元素對于成骨有著良好的促進作用(見圖5)。

注：*與MPC組比較，P<0.05 注：*與MPC組比較，P<0.05

2.6 成骨相關基因表達 與MPC組相比較，隨著氧化鍶添加比例的上升，添加氧化鍶的骨水泥組其OC與RUNX2的基因表達有較為明顯的升高(見圖6)。OC與RUNX2的表達上升反映出鍶元素對于成骨相關基因的表達起著促進作用。這也表明，鍶元素作為成骨相關的一種影響因子，它能夠促進MC3T3-E1成骨前細胞進一步向成骨方向分化。

2.7 細胞電鏡 通過物化性能的比較及相關生化實驗的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)鍶的加入對于成骨細胞的增殖和分化有較好的

a OC基因表達量 b RUNX2基因表達量

促進作用，以Sr-MPC-8組的結(jié)果最優(yōu)。因此，我們選取對照組MPC和最優(yōu)組Sr-MPC-8組，在材料上種植MC3T3-E1成骨前細胞，培養(yǎng)7 d后掃描電鏡下觀察。MPC組電鏡圖顯示，黏附的MC3T3-E1成骨前細胞數(shù)量少，且偽足較少；而Sr-MPC-8組其電鏡圖上黏附的MC3T3-E1成骨前細胞數(shù)量多，且偽足較多，延展佳，明顯具備更好的黏附性(見圖7)?？紤]這與鍶元素促進成骨前細胞成骨相關基因的表達有關，例如黏著斑的表達等使細胞更好地黏附于材料表面，因此導致在電鏡下細胞形態(tài)產(chǎn)生一定的差異。

圖7 兩組電鏡下材料表面細胞圖

2.8 HE染色 選取1個月后大鼠頂骨骨缺損模型制成HE染色切片。與MPC組相比較，Sr-MPC-8組HE染色可見骨缺損處骨折愈合線更加完整、致密，有更多的新骨生成。這與鍶元素本身就是作為成骨相關的影響因子有關，鍶元素促進成骨表達，因此加速了骨缺損的修復。說明添加氧化鍶的新型MPC可以促進體內(nèi)骨缺損的修復，加快體內(nèi)新骨的生成(見圖8)。

圖8 大鼠頂骨骨缺損模型染色結(jié)果(HE，×40)

3 討 論

MPC作為一種新型人工骨替代材料，近年來對其研究備受人們關注。MPC由于其出色的特性，有望成為一種超越PMMA骨水泥和CPC的新型骨替代物。但單純MPC仍存在一定的不足之處，這使得對于MPC的改性成為人們研究的重點及熱點方向[13]。臨床上對于人工骨替代品的要求，主要集中于減少免疫排斥反應和促進新骨的形成。尤其是人工骨替代品對于新骨形成的促進作用，是目前眾多專家研究的主要方向[14]。

本研究通過對鍶元素的學習和早期對磷酸鎂骨水泥的探索，考慮通過添加鍶對MPC進行改性，研究Sr-MPC性質(zhì)的改良及其對體內(nèi)骨缺損修復的影響。研究中，制備添加不同比例氧化鍶的MPC，以MPC作為對照組，Sr-MPC為實驗組，探究新型MPC對骨缺損的修復影響。

適宜的凝固時間及降解率、適當?shù)臋C械強度等理化性質(zhì)是骨水泥材料必備條件之一。該研究發(fā)現(xiàn)，Sr-MPC組的凝固時間隨著氧化鍶比例的上升而有所延長；這可能與氧化鍶的加入延緩了氧化鎂的溶解有關，一定程度上延緩了MPC的水和反應，進而延長了新型MPC的凝固時間。在放熱溫度的測量中，我們發(fā)現(xiàn)該復合材料的放熱溫度隨著氧化鍶添加比例的上升而隨之上升，這是由于該反應的產(chǎn)熱實質(zhì)上為酸堿中和反應放熱[15]，而氧化鍶與液相去離子水反應生成的氫氧化鍶可以與酸性磷酸二氫鹽反應放熱，使材料的放熱溫度上升。研究發(fā)現(xiàn)，氧化鍶的加入一定程度上影響了KMgPO4·6H2O晶體的生成，鍶元素通過填補KMgPO4·6H2O晶體之間的裂隙使晶體的排列更為致密[16]；在電鏡下可以清楚地觀察到MPC組骨水泥材料存在較多的裂痕、晶體排列較為疏松，而新型MPC材料表面則簇集著顆粒狀的細小晶體，排列較為致密。根據(jù)此前MPC的研究，KMgPO4·6H2O晶體是影響MPC力學性能的微觀基礎[17]，KMgPO4·6H2O晶體之間的裂隙被鍶元素有效填補，是導致添加氧化鍶的骨水泥材料力學性能增強的主要原因之一。同時，由于KMgPO4·6H2O晶體之間的裂隙被鍶元素有效填補，骨水泥的力學性能得以加強，微觀上晶體排列更加致密，使得材料的體外降解性能表現(xiàn)出了下降的趨勢。

良好的成骨作用是目前學者們對新型骨水泥的一個重要考量指標。該實驗發(fā)現(xiàn)Sr-MPC在成骨細胞黏附、增殖和分化層面也表現(xiàn)出良好的促進作用。通過測量OD值發(fā)現(xiàn)，與MPC組相比較，新型MPC材料組其細胞數(shù)量明顯增多；通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在新型MPC材料表面MC3T3-E1成骨前細胞數(shù)量更多且擁有更多地偽足，并且可以觀察到細胞在材料表面具有更佳的延伸性。另外，可直接反映成骨細胞的活性及功能狀況的表型標志物之一ALP，在新型MPC材料組有著更高的表達[18]。同時，成骨相關基因也在新型MPC材料組有著更高的表達。細胞實驗結(jié)果表明，新型MPC材料能夠更好地促進MC3T3-E1成骨前細胞向成骨方向進一步轉(zhuǎn)化，同時也可以促進成骨基因表達。大鼠頂骨骨缺損模型動物實驗進一步證實新型MPC可以促進體內(nèi)骨缺損的修復與新骨的生成。

研究發(fā)現(xiàn)，新型MPC材料與單純MPC相比較，其理化性質(zhì)有一定程度地提升，而它在生物學性能上的提升更為顯著。這種新型MPC材料能夠促進MC3T3-E1成骨前細胞更好地黏附、增殖及分化，可以促進大鼠體內(nèi)骨缺損的修復，有利于新骨的形成，有望成為一種理想的人工骨替代材料。

綜上所述，本研究證實了可以通過添加氧化鍶來對MPC進行改性，且該新型骨水泥的理化性能和生物學性能均有所改善。添加8%質(zhì)量分數(shù)氧化鍶的MPC材料在力學性能及生物學性能方面的提升最為顯著，主要表現(xiàn)在微觀結(jié)構(gòu)更致密及力學強度更高，同時也顯著的促進成骨細胞成熟分化及骨的形成。動物實驗結(jié)果再次驗證了該新型含鍶MPC對大塊骨缺損的修復功能，故該實驗對于MPC改性策略及大塊骨缺損修復等方面的研究提供了一條新的思路并具備有一定的潛在價值。然而該實驗目前僅僅停留在實驗室及動物實驗水平，后期還需要大量的研究才可能應用于臨床。