miR-199a-5p、HIF-1a在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其臨床意義

馬素剛，陳萬(wàn)軍，王春艷，李 楊，孟明晨

(1.濟(jì)南市章丘區(qū)人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，山東 濟(jì)南 250117)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最為常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，占80%以上[1]。盡管PTC手術(shù)治療效果較好，然而一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，會(huì)極大縮短患者的生存時(shí)間，5年生存率明顯降低[2]。因此，尋找敏感的檢測(cè)指標(biāo)及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)對(duì)PTC患者手術(shù)方式的選擇、臨床治療方案的制訂、改善預(yù)后及降低病死率均有重要意義。近年來(lái)，微小RNA(microRNA,miRNA)在腫瘤相關(guān)疾病的研究中較為熱門(mén)。miR-199a在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。以往研究顯示，miR-199a-5p在PTC細(xì)胞和組織中呈低表達(dá)[4]，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)[5]。基于此，本研究擬進(jìn)一步探討miR-199a-5p及HIF-1α在PTC組織中的表達(dá)及其臨床意義，以期為PTC的臨床治療及新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年1月～12月我院收治的50例PTC患者為研究對(duì)象，收集患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織。50例PTC患者中男11例，女39例；年齡38～70歲，平均(57.46±6.29)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》[6]中PTC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后病理確診；②年齡18歲及以上；③術(shù)前未行放化療及生物治療；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；②伴有其他惡性腫瘤；③有內(nèi)分泌疾病；④孕婦或哺乳期女性。本研究經(jīng)濟(jì)南市章丘區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(EC20190802-1030)。

1.2 原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)miR-199a-5p的表達(dá)

癌組織及癌旁組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，室溫保存待用。3%過(guò)氧化氫溶液室溫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；暴露RNA核酸片段；滴加原位雜交試劑盒胃蛋白酶(博士德)預(yù)雜交，切片放入預(yù)雜交濕盒并滴加預(yù)雜交液進(jìn)行雜交，加入miRNA buffer稀釋地高辛，用以標(biāo)記miR-199a-5p探針，蓋玻片覆蓋過(guò)夜；采用PBS清洗切片，滴加生物素化鼠抗地高辛，再次清洗后滴加生物素化過(guò)氧化物酶，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水、透明，并在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。miR-199a-5p定位在腫瘤細(xì)胞胞漿則為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)

石蠟切片脫蠟、梯度脫水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，BSA封閉，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。由兩位不清楚患者狀況的病理科專(zhuān)家獨(dú)立閱片及評(píng)分，取平均值，若分歧過(guò)大則請(qǐng)另一位專(zhuān)家參評(píng)。染色呈棕黃色或黃褐色細(xì)小顆粒則為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色陽(yáng)性細(xì)胞率記分標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀(guān)察，記錄陽(yáng)性細(xì)胞率，低于1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，80%以上為4分。采用免疫反應(yīng)評(píng)分系統(tǒng)，即染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞率得分的乘積則為綜合得分，綜合得分≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)

收集患者的性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等資料。所有患者術(shù)后均隨訪(fǎng)12～60個(gè)月，平均(53.70±4.25)個(gè)月，無(wú)失訪(fǎng)病例。生存時(shí)間為術(shù)后至2020年12月，或至死亡、復(fù)發(fā)等不良預(yù)后的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析miR-199a-5p及HIF-1α表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系；采用Cox回歸分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素；采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析miR-199a-5p與HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析患者的5年生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織中miR-199a-5p、HIF-1α的表達(dá)

癌組織中miR-199a-5p的陽(yáng)性表達(dá)率為22.00%(11/50)，顯著低于癌旁組織的52.00%(26/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.263，P=0.000)。癌組織中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率為58.00%(29/50)，顯著高于癌旁組織的16.00%(8/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.451，P=0.000)，見(jiàn)圖1。

2.2 miR-199a-5p、HIF-1α表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡患者癌組織中miR-199a-5p、HIF-1α的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤直徑≥4 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者癌組織中miR-199a-5p陰性表達(dá)率及HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于腫瘤直徑<4 cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)，見(jiàn)表1。

a：miR-199a-5p(原位熒光雜交，×100)；b：HIF-1α(免疫組化染色，×200)

臨床特征nmiR-199a-5p陽(yáng)性表達(dá)陰性表達(dá)χ2PHIF-1α陽(yáng)性表達(dá)陰性表達(dá)χ2P性別男112(18.18)9(81.82)1.0470.3896(54.55)5(45.45)0.8430.562女399(23.08)30(76.92)23(58.97)16(41.03)年齡<60歲205(25.00)16(80.00)0.9860.42212(60.00)8(40.00)1.0120.403≥60歲306(12.00)23(76.67)17(56.67)13(43.33)腫瘤直徑<4 cm4310(23.26)33(76.74)10.9720.00023(53.49)20(46.51)13.6580.000≥4 cm71(14.29)6(85.71)6(85.71)1(14.29)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)299(31.03)20(68.97)11.7530.00011(37.93)18(62.07)15.3050.000有212(9.52) 19(90.48)18(85.71)3(14.29)TNM分期Ⅰ～Ⅱ期329(28.13)23(71.88)9.6280.00414(43.75)18(56.25)11.6920.000Ⅲ～Ⅳ期182(11.11)16(88.89)15(83.33)3(16.67)

2.3 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

以miR-199a-5p(0=陽(yáng)性表達(dá)，1=陰性表達(dá))、HIF-1α(0=陰性表達(dá)，1=陽(yáng)性表達(dá))、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0=無(wú)，1=有)、TNM分期(0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期)為自變量，以患者的預(yù)后為因變量進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，miR-199a-5p陰性表達(dá)、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 Cox回歸分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

2.4 危險(xiǎn)因素之間的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期之間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；癌組織中miR-199a-5p表達(dá)與HIF-1α表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.795，P=0.000)，見(jiàn)圖2。

圖2 患者癌組織中miR-199a-5p表達(dá)與HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性

2.5 患者的生存分析

在隨訪(fǎng)期間，50例患者中有43例存活，7例死亡，存活率為86.00%。miR-199a-5p陽(yáng)性表達(dá)患者的5年生存率為100%(11/11)，明顯高于miR-199a-5p陰性表達(dá)患者的82.05%(32/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HIF-1α陰性表達(dá)患者的5年生存率為95.24%(20/21)，明顯高于HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)患者的79.31%(23/29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：miR-199a-5p；b：HIF-1α

3 討論

PTC在臨床上較常見(jiàn)，其發(fā)生受激素、遺傳、環(huán)境等因素的影響。近年來(lái)，PTC的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，早期識(shí)別PTC及評(píng)估預(yù)后對(duì)患者具有重要意義。但影響PTC患者預(yù)后的因素較多，且目前尚無(wú)公認(rèn)的PTC早期篩查及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。

本研究中與癌旁組織比較，癌組織中miR-199a-5p的陰性表達(dá)率及HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，提示在PTC組織中miR-199a-5p低表達(dá)，HIF-1α高表達(dá)。HIF-1α是Snai1的轉(zhuǎn)錄因子，以往研究顯示，PTC組織中miR-199a-5p表達(dá)明顯下調(diào)，Snai1表達(dá)明顯上調(diào)，miR-199a-5p過(guò)表達(dá)和Snai1敲低可在體外抑制PTC細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞侵襲性降低，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化減少[4，7]。曾勇等[8]的研究顯示，HIF-1α在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織；肖小琴等[9]的研究顯示，PTC組織中HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)。由此推測(cè)，在PTC的進(jìn)展過(guò)程中，miR-199a-5p低表達(dá)使其靶基因HIF-1α高轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，提示miR-199a-5p/HIF-1α可能成為PTC的診療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，miR-199a-5p陰性表達(dá)、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑≥4 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期有關(guān)，miR-199a-5p與HIF-1α的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。Wang等[10]的研究顯示，沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA 1通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p促進(jìn)PTC細(xì)胞凋亡；董斌[11]的研究顯示，HIF-1α在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率增高，且與TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，本研究結(jié)果與之基本一致。miR-199a-5p在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)，提示miR-199a與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。miR-199a的兩種成熟體miR-199a-3p和miR-199a-5p在多種腫瘤中有不同的靶基因，發(fā)揮不同的調(diào)控功能。miR-199a-5p主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡[14]。HIF-1α是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，靶基因譜非常廣泛，包括與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展及腫瘤生長(zhǎng)等相關(guān)的近百種靶基因[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-5p可下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞停留在G1期[16]；同時(shí)也有研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-199a-5p能顯著抑制肝癌的發(fā)展速度[17]；此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p可通過(guò)靶向結(jié)合HIF-1α mRNA的3’-UTR，調(diào)控HIF-1α基因參與的信號(hào)通路中相關(guān)分子的表達(dá)，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。RNA測(cè)序分析及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-199家族對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲、遷移具有明顯的抑制作用[19]。以上研究表明，miR-199a-5p可對(duì)HIF-1α進(jìn)行負(fù)性靶向調(diào)控，可能是miR-199a-5p/HIF-1α調(diào)控PTC細(xì)胞增殖、遷移等過(guò)程的機(jī)制之一，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p陰性表達(dá)、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期是影響PTC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；miR-199a-5p陽(yáng)性表達(dá)患者的5年生存率明顯高于陰性表達(dá)患者，HIF-1α陰性表達(dá)患者的5年生存率明顯高于陽(yáng)性表達(dá)患者。這提示miR-199a-5p可能是一種抑癌基因，miR-199a-5p低表達(dá)上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移，使得臨床分期較晚，促進(jìn)疾病進(jìn)展，導(dǎo)致患者預(yù)后不良，生存率降低[20-21]。因此，miR-199a-5p/HIF-1α可以作為PTC早期識(shí)別及預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。

綜上所述，PTC組織中miR-199a-5p低表達(dá)，HIF-1α高表達(dá)，且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并與臨床特征及5年生存率密切相關(guān)，是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。但miR-199a-5p/HIF-1α在PTC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等過(guò)程中的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。