膝關節(jié)骨關節(jié)炎中miR-1271的表達及其與ERG的相關性分析

俞東升,董 濤,夏洪超,徐 建

(青島市第八人民醫(yī)院骨科,山東 青島 266555)

骨關節(jié)炎是以軟骨退行性變和繼發(fā)骨質(zhì)增生為主的骨關節(jié)疾病，多見于中老年人[1-2]，但目前其具體發(fā)病機制仍未完全闡明。近年來，越來越多的研究顯示，microRNAs在骨關節(jié)炎的發(fā)病機制中具有關鍵性調(diào)控作用[3-5]。已有研究顯示，miR-1271在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等疾病中具有調(diào)控細胞增殖、凋亡等作用，而E26轉錄因子(E26 transformation-specific,ETS)相關基因(ETS-related gene,ERG)被證明在誘導軟骨細胞分化中發(fā)揮重要作用[6-8]，但在膝關節(jié)骨關節(jié)炎中miR-1271與ERG的關系尚未見報道。本研究選取我院膝關節(jié)滑液標本，通過qRT-PCR檢測樣本中miR-1271、ERG的表達水平，雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-1271與ERG的靶向結合關系，旨在為深入了解膝關節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)病機制并開發(fā)潛在的治療靶點提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月至2020年12月我院骨科收治的60例膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者作為OA組，其中男29例，女31例；年齡(64.90±15.23)歲；左側24例，右側36例。OA組患者的診斷標準參考中華醫(yī)學會骨科學分會2007年制定的骨關節(jié)炎診治指南[9]，排除合并肝腎等嚴重器質(zhì)性疾病、過敏體質(zhì)、類風濕因子陽性、精神類疾病及血沉、C反應蛋白異?；颊?。另選取我院同期收治的60例外傷導致的單純膝關節(jié)半月板損傷患者(非OA組)作為對照，其中男32例，女28例；年齡(61.56±13.26)歲；左側25例，右側35例。2組性別、年齡、發(fā)病部位比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批(2019024)，所有患者均知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

Nanodrop微量紫外分光光度計(1011U，美國Thermo公司)，C1000熱循環(huán)儀(美國Bio-RAD公司)，Glomax20/20 luminometer熒光檢測儀(美國Promega公司)。mirVanaTMmiRNA分離試劑盒、TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcrption試劑盒(德國QIAGEN公司)，雙熒光素酶檢測試劑盒(E1910，美國Promega公司)。轉染質(zhì)粒(NC-mimic、miR-1271、PGLO-ERG WT、PGLO-ERG MUT)及Oligofectamine轉染試劑(上海生工生物公司)。293T細胞購自上海中科院細胞庫，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中，用含10%胎牛血清(美國Gibco公司)、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM(美國Gibco公司)培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 患者取平臥位,膝關節(jié)局部消毒麻醉后,取髕上外側入路行膝關節(jié)腔穿刺,抽取關節(jié)液約2 mL,室溫下靜置1 h；3 000 r/min離心20 min，去除細胞和關節(jié)組織殘存碎片,取上清置于1.5 mL微量離心管中，-80 ℃冰箱保存待后續(xù)檢測。

1.3.2 qRT-PCR 用Trizol法提取總RNA。采用Nanodrop微量紫外分光光度計檢測提取的總RNA濃度和純度。以U6為實驗內(nèi)參，設計miR-1271、ERG、U6的引物(表1)。在C1000熱循環(huán)儀中使用GoScript TM逆轉錄系統(tǒng)進行qRT-PCR。采用相對定量法(2-ΔΔCT)計算樣本中miR-1271、ERG的相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 雙熒光素酶報告基因實驗 利用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-1271與ERG是否存在靶向關系。分別構建靶基因ERG雙熒光素酶報告基因載體以及與miR-1271結合位點的突變體：PGLO-ERG WT、PGLO-ERG MUT。將熒光素酶報告質(zhì)粒分別與miR-1271 mimic和陰性對照NC mimic共轉染至293T細胞中，轉染12 h后，加入DMSO處理24 h，收集不同組細胞，1×PBS洗滌后使用雙熒光素酶檢測試劑盒的緩沖液裂解細胞，用Glomax20/20 luminometer熒光檢測儀檢測firefly和Renilla熒光素酶活性，以Renilla熒光素酶活性為內(nèi)參，將firefly熒光素酶活性的相對表達歸一化為Renilla熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測結果

qRT-PCR檢測結果顯示，與非OA組相比，OA組miR-1271顯著高表達，而ERG顯著低表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 患者miR-1271、ERG表達水平比較

2.2 Spearman分析關節(jié)滑液中miR-1271與ERG的相關性

Spearman分析結果顯示：OA組關節(jié)滑液中miR-1271與ERG的表達呈負相關(r=-0.746，P=0.013)，且在非OA組關節(jié)滑液中miR-1271與ERG的表達也呈負相關(r=-0.723，P=0.024)。提示miR-1271與ERG在關節(jié)滑液中的表達呈顯著負相關。

2.3 雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果

與共轉染NC mimic和PGLO-ERG WT細胞相比，共轉染miR-1271 mimic和PGLO-ERG WT細胞的熒光強度顯著降低(P<0.001)；而共轉染NC mimic和PGLO-ERG MUT細胞與共轉染miR-1271 mimic和PGLO-ERG MUT細胞的熒光強度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明miR-1271能特異性結合并抑制ERG表達，見表3。

表3 患者雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果比較

3 討論

microRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度20～22 nt，在轉錄后水平調(diào)控靶基因的表達[10-13]。microRNAs與骨關節(jié)炎密切相關[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs可能通過影響軟骨細胞凋亡、炎癥反應和細胞外基質(zhì)降解，在骨關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-16]。

miR-1271定位于人染色體5q35.2上，與細胞增殖、侵襲、分化和凋亡等密切相關[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271在前列腺癌、結直腸癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[17-18]，然而其在膝關節(jié)骨關節(jié)炎中的作用尚未見報道。本研究結果顯示，與非OA組比較，miR-1271在OA組膝關節(jié)滑液中顯著高表達。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271可通過促進人軟骨細胞凋亡，降低細胞外基質(zhì)的合成[19]。以上結果提示miR-1271可能參與膝關節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)生。

ERG作為轉錄因子ETS基因家族成員之一，定位于染色體21q22.3，編碼蛋白有1個與ETS同源的由84個氨基酸組成的DNA結合區(qū)域[6]。ERG作為microRNAs(如miR-204、miR-200b-3p)的下游靶點，在細胞增殖、分化、凋亡和免疫炎癥損傷等病理生理過程中起到重要作用[20-21]。ERG被證明在誘導軟骨細胞分化中發(fā)揮重要作用[6-8]，本研究結果顯示，OA組ERG表達水平明顯低于非OA組，提示ERG可能參與膝關節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)生，與既往報道一致[8]。ERG是miR-1271的靶基因，miR-1271/ERG信號通路與細胞增殖、凋亡有關[22]。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-1271與ERG的靶向結合作用。說明miR-1271可能通過ERG參與膝關節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，miR-1271在膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者關節(jié)滑液中顯著高表達，而ERG在膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者關節(jié)滑液中顯著低表達，且miR-1271可靶向ERG進行負性調(diào)控，可為未來膝關節(jié)骨關節(jié)炎的治療提供新的策略。但本研究樣本量有限，結果可能存在偏倚，研究結論未來還需多中心、大樣本量的臨床研究來證實。