ADAMTS14在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)和作用機(jī)制

黃 尉，韓均凌，沈宏峰

(1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)928醫(yī)院泌尿外科，海南 ?？?570206；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)928醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?570206)

腎細(xì)胞癌是常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌，且其發(fā)病率和病死率逐年上升[1]。腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是腎細(xì)胞癌最常見(jiàn)的病理亞型，占70%～85%[2]。早期ccRCC患者主要依賴(lài)手術(shù)治療，而對(duì)于晚期ccRCC患者而言，治療方式的選擇十分有限[3-4]。靶向治療是目前晚期ccRCC患者的主要治療方式之一，但由于存在毒副作用以及耐藥性，多數(shù)患者的預(yù)后仍較差[4-5]。因此，尋找新型靶向生物標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)于改善晚期ccRCC患者的預(yù)后具有十分重要的意義。

Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶14(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 14,ADAMTS14)定位于10q22.1區(qū)域，具有25個(gè)外顯子區(qū)域。該基因主要編碼ADAMTS蛋白，ADAMTS蛋白可催化細(xì)胞外基質(zhì)中的多種底物[6]。有研究顯示，ADAMTS14與血液凝固、動(dòng)脈粥樣硬化、傷口愈合、血管生成、生育能力、關(guān)節(jié)炎和癌癥等病理生理過(guò)程相關(guān)[7]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究在多種人類(lèi)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)ADAMTS14異常表達(dá)。Lin等[8]發(fā)現(xiàn)ADAMTS14在口腔癌組織中低表達(dá)，且ADAMTS14的低表達(dá)與患者較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、更晚期的臨床分期和較差的預(yù)后顯著相關(guān)。Su等[9]發(fā)現(xiàn)ADAMTS14基因多態(tài)性和環(huán)境誘變劑之間的相互作用是口腔癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且ADAMTS14的非同義單核苷酸多態(tài)性rs12774070與口腔癌細(xì)胞分化程度有關(guān)。Sheu等[10]研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS14的非同義單核苷酸多態(tài)性(rs12774070和rs61573157)參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。此外，Song等[11]發(fā)現(xiàn)ADAMTS14可通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA-572/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶1調(diào)節(jié)劑抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展。ADAMTS14在多種惡性腫瘤中具有致癌潛力，但目前尚未見(jiàn)其在ccRCC中的相關(guān)報(bào)道。基于此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤學(xué)數(shù)據(jù)資源進(jìn)行二次分析，探索ADAMTS14與ccRCC的相關(guān)性，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)可以系統(tǒng)分析不同癌癥類(lèi)型中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，其“DiffExp”模塊可以分析任何基因在TCGA所有腫瘤組織和正常組織之間的表達(dá)差異。本研究首先通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析ADAMTS14在33種惡性腫瘤中的表達(dá)。

1.2 TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)

TCGA可通過(guò)大規(guī)模高通量測(cè)序分析技術(shù)創(chuàng)建全面的癌癥基因組圖譜[13]。本研究從該數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了72個(gè)正常腎組織樣本和530個(gè)ccRCC組織樣本的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，以及530例ccRCC患者的臨床資料(表1)。此外，本研究從ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)[14]中獲得了45個(gè)正常腎組織樣本和91個(gè)ccRCC組織樣本的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.3 GEPIA和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)包含來(lái)自TCGA和GTEx項(xiàng)目的9 736個(gè)腫瘤樣本和8 587個(gè)正常樣本的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)[15]。其“survival”模塊可以根據(jù)基因表達(dá)進(jìn)行總生存率或無(wú)病生存率分析。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)能夠評(píng)估54 000多個(gè)基因?qū)?1種癌癥生存預(yù)后的影響，該工具的主要目的為發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證腫瘤預(yù)后生物標(biāo)記物[16]。本研究采用以上2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析ADAMTS14對(duì)ccRCC患者生存預(yù)后的影響。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ccRCC患者的臨床資料

1.4 ADAMTS14高低表達(dá)組之間的差異表達(dá)基因和功能分析

為了探索ADAMTS14在ccRCC中的潛在作用機(jī)制，本研究獲取了ADAMTS14高低表達(dá)亞組之間的差異基因。根據(jù)ADAMTS14的表達(dá)中位值，將530例患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用R語(yǔ)言的“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)分析[17]，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05且logFC絕對(duì)值大于1(變化倍數(shù)為2倍)的基因被視為2組的差異表達(dá)基因，通過(guò)R語(yǔ)言的“clusterProfiler”程序包對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析[18]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R 3.6.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)比較ccRCC組織和正常腎組織中ADAMTS14的表達(dá)差異，采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)評(píng)估ADAMTS14表達(dá)對(duì)ccRCC患者生存預(yù)后的影響，采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法探討ccRCC患者臨床病理變量與ADAMTS14表達(dá)水平的關(guān)系。通過(guò)單變量和多變量Cox回歸分析確定獨(dú)立預(yù)后因素和臨床變量。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAMTS14在泛癌中的表達(dá)

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，ADAMTS14在乳腺浸潤(rùn)癌、膽管癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、ccRCC、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、直腸腺癌、胃癌、甲狀腺癌以及子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達(dá)(P<0.001)，見(jiàn)圖1a。

2.2 ADAMTS14在ccRCC中的表達(dá)驗(yàn)證

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA數(shù)據(jù)分析顯示，與正常腎組織相比，ADAMTS14在ccRCC組織中顯著高表達(dá)(P<0.001)，見(jiàn)圖1b。ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與正常腎組織相比，ADAMTS14在ccRCC組織中顯著高表達(dá)(P<0.001)，見(jiàn)圖1c。

2.3 ADAMTS14表達(dá)與ccRCC患者臨床病理特征的相關(guān)性

ADAMTS14與患者的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期以及TNM分期有關(guān)，隨著ADAMTS14的上調(diào)，組織學(xué)分級(jí)、臨床分期以及TNM分期越高，見(jiàn)圖2、表2。

a:ADAMTS14在泛癌中的表達(dá)(TIMER數(shù)據(jù)庫(kù))；b:ADAMTS14在正常腎組織及ccRCC組織中的表達(dá)(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))；c:ADAMTS14在正常腎組織及ccRCC組織中的表達(dá)(ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)) ***:與正常組織比較，P<0.001

a:臨床分期;b:組織學(xué)分級(jí);c:T分期;d:N分期;e:M分期

表2 ADAMTS14表達(dá)水平與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 ADAMTS14表達(dá)對(duì)ccRCC患者預(yù)后的影響

ADAMTS14高表達(dá)的患者總體生存率明顯低于低表達(dá)的患者(圖3a)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果亦顯示，ADAMTS14表達(dá)水平越高，患者總體生存率越低(圖3b)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，ADAMTS14高表達(dá)與患者較低的總體生存率和無(wú)病生存率顯著相關(guān)(圖3c、d)。

2.5 獨(dú)立預(yù)后因素和臨床變量的鑒定

ADAMTS14高表達(dá)是ccRCC患者總體生存率較低的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=1.179,P<0.05)；年齡較大也是ccRCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=1.034,P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 單變量和多變量Cox回歸分析

2.6 ADAMTS14在ccRCC中的潛在作用機(jī)制

基于錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05且logFC絕對(duì)值大于1(變化倍數(shù)為2倍)的條件，本研究從ADAMTS14高低表達(dá)中鑒定出了1 230個(gè)差異表達(dá)基因。圖4a、b分別為差異表達(dá)基因的熱圖和火山圖。GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)基因富集在細(xì)胞外基質(zhì)及其受體的相互作用、細(xì)胞因子及其受體的相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路等已知的癌癥相關(guān)生物學(xué)過(guò)程和通路中(圖5)。

a～b:ADAMTS14表達(dá)對(duì)患者總體生存率的影響(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù))；c～d:ADAMTS14表達(dá)對(duì)患者總體生存率和無(wú)病生存率的影響(GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù))

a：熱圖；b：火山圖

a:GO功能注釋?zhuān)籦:KEGG通路富集分析

3 討論

ccRCC是高度異質(zhì)性的泌尿系惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制目前尚不完全清楚。靶向治療是晚期ccRCC患者的主要治療方式，但研究表明僅有20%～40%的患者從中獲益，多數(shù)高?；颊叩念A(yù)后仍較差。探索新型生物標(biāo)記物及其潛在的作用機(jī)制，對(duì)于理解ccRCC的發(fā)病機(jī)制以及改善患者預(yù)后有重要意義。因此，本研究基于生物信息學(xué)探索ADAMTS14作為ccRCC潛在治療靶點(diǎn)的可能性。

本研究結(jié)果顯示，ADAMTS14在多種人類(lèi)惡性腫瘤中高表達(dá)，其在ccRCC組織中也呈上調(diào)趨勢(shì)；臨床病理相關(guān)性分析顯示，隨著ADAMTS14表達(dá)的升高，ccRCC患者的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、TNM分期越高；生存分析顯示，ADAMTS14高表達(dá)與患者較低的總體生存率和無(wú)病生存率相關(guān)；單變量和多變量Cox分析結(jié)果顯示，ADAMTS14高表達(dá)是ccRCC患者總體生存率較低的獨(dú)立預(yù)后因素?；谝陨辖Y(jié)果，本研究推測(cè)，ADAMTS14可能是ccRCC的潛在促癌因子，有望成為ccRCC的潛在預(yù)后生物標(biāo)記物。

為了探索ADAMTS14在ccRCC中的潛在作用機(jī)制，本研究獲取了ADAMTS14高低表達(dá)組之間的差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因富集在經(jīng)典的腫瘤信號(hào)通路，如細(xì)胞外基質(zhì)及其受體的相互作用、細(xì)胞因子及其受體的相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路，而這些信號(hào)通路被證實(shí)在癌癥中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞外基質(zhì)由結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜的大分子混合物組成，在組織器官的形態(tài)發(fā)生以及組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能維持上發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)及其受體相互作用，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的直接或間接控制，如黏附、遷移、分化、增殖及凋亡。有研究證實(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)及其受體相互作用的失調(diào)與多種癌癥的進(jìn)展有關(guān)[19]。細(xì)胞因子及其受體的相互作用在先天性免疫和抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被證實(shí)在腫瘤進(jìn)程中扮演重要角色[20]。PI3K-Akt信號(hào)通路是經(jīng)典的腫瘤信號(hào)相關(guān)通路，其可被多種類(lèi)型的細(xì)胞損傷激活，進(jìn)一步調(diào)節(jié)基本的細(xì)胞功能，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長(zhǎng)和存活[21]。由于PI3K-Akt信號(hào)通路在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，靶向該信號(hào)通路的藥物研發(fā)也引起了人們的關(guān)注。正常生理狀態(tài)下，IL-17信號(hào)通路主要在保護(hù)宿主免受細(xì)胞外病原體侵害等方面發(fā)揮作用；病理狀態(tài)下，IL-17信號(hào)通路的異常激活與腫瘤免疫密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為：IL-17是Th17衍生的細(xì)胞因子，可以通過(guò)直接促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞特性和鄰近基質(zhì)細(xì)胞活性來(lái)影響腫瘤微環(huán)境；此外，IL-17還可通過(guò)調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞和T細(xì)胞的活性參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[22]。結(jié)合本研究以上結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)ADAMTS14可能通過(guò)IL-17信號(hào)通路參與ccRCC的進(jìn)程。

綜上所述，ADAMTS14具有作為ccRCC預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的潛力，ADAMTS14潛在調(diào)控信號(hào)通路是理解ccRCC發(fā)病機(jī)理的突破點(diǎn)。但本研究也存在局限性，缺乏ccRCC中ADAMTS14蛋白水平的證據(jù)，且ADAMTS14影響ccRCC患者預(yù)后的確切機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究以驗(yàn)證該結(jié)論。