舒肝寧注射液對(duì)非酒精性脂肪性肝病組織工程肝保護(hù)作用的機(jī)制研究*

隨著經(jīng)濟(jì)、飲食及生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病率逐年升高，已成為慢性肝臟疾病的主要原因。NAFLD起病隱匿且進(jìn)展緩慢，目前除改變生活方式、減輕體重外，尚缺乏特效治療藥物。NAFLD 的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜

，其中氧化應(yīng)激在 NAFLD 的發(fā)展中起關(guān)鍵作用

。當(dāng)肝臟細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)載時(shí)，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，肝臟出現(xiàn)脂肪變性， ROS的增加促進(jìn)了游離脂肪酸(FFA)的氧化，導(dǎo)致了脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的增多。脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝為丙二醛(MDA)和4-羥基壬醛(4-HNE)。ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物生成增加(丙二醛(MDA)和4-羥基壬醛(4-HNE))可直接造成細(xì)胞損傷，引起NASH和肝纖維化

。舒肝寧注射液(SGN)是一種中藥復(fù)方注射制劑，所含黃芩苷、綠原酸、梔子苷等成分，具有抗病毒作用，同時(shí)能清除氧化自由基，減少炎性細(xì)胞因子表達(dá)，抑制肝纖維化

。目前關(guān)于舒肝寧注射液的臨床作用相關(guān)研究較多，但對(duì)其治療NAFLD的作用機(jī)制研究較少。本研究以NAFLD新型組織工程肝(TE)模型和組織工程脂肪肝(TEF)模型為基礎(chǔ)，旨在探討舒肝寧注射液對(duì)NAFLD肝臟的干預(yù)效果及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼喂條件 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)用健康成年雄性大鼠，體重200～250 g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。室溫約23℃，濕度70%，常規(guī)消毒飼料和飲用水，自由進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)研究方案經(jīng)由北京佑安醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：AEEI-2020-076) ，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 主要儀器 生物分光光度計(jì)(美國(guó) IMPLEN 公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo Fisher 公司)，蠕動(dòng)泵(美國(guó) Masterflex,thermo fisher 公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(上海Hyclone公司)，胎牛血清、青霉素/鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)，0.25%胰酶、SDC粉劑、磷脂酶A2、油酸、棕櫚酸(美國(guó)sigma公司)，CCK-8檢測(cè)試劑盒(東仁化學(xué)科技(上海)有限公司)，蛋白質(zhì)定量試劑盒、線粒體膜電位Jc-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，MDA檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；舒肝寧注射液(2 ml/支)由貴州瑞和制藥有限公司提供。

1.4 方法

1.4.7 免疫熒光染色 組織工程肝研磨的細(xì)胞，PBS洗滌，4%的多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透化，5% BSA室溫封閉，加一抗(小鼠抗人ATP5A，Thermo公司)4℃過(guò)夜，PBS清洗后二抗(羊抗小鼠TRITC標(biāo)記，索萊寶公司)避光孵育1 h，95%甘油封片拍照。

1.4.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)(CCK-8法) 在96孔板中每孔加入100 μl的人HepG2細(xì)胞懸液(40～60個(gè)/μl)。孵育24 h后向96孔板加入不同稀釋濃度的舒肝寧注射液，作用24 h后每孔加入10 μl CCK溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度來(lái)計(jì)算細(xì)胞毒性。

1.4.3 原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 組織工程肝研磨的細(xì)胞或冰凍切片用500 μl 4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，2% Triton 破膜后，再次PBS洗滌，加上50 μl TUNEL染液37℃避光孵育60 min，洗滌后用熒光分光光度儀檢測(cè)或熒光顯微鏡觀察分析。

1.4.4 細(xì)胞丙二醛(MDA)檢測(cè) 用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下加試劑60 μl+樣品60 μl，混勻，將細(xì)胞破碎制成懸液，取樣0.1 ml按操作表配好試劑，混勻，95℃以上水浴，冷卻，離心，波長(zhǎng)530 nm多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度再計(jì)算。

命題人在選項(xiàng)中常常故意顛倒因果或無(wú)理地構(gòu)建推理，因此考生要將選項(xiàng)內(nèi)容與原文邏輯仔細(xì)核對(duì)，看看是否有出入。比如《中國(guó)古代星宿》一文，第三題的題干是“根據(jù)原文內(nèi)容，下列理解和分析不正確的一項(xiàng)是（ ）”，該題C項(xiàng)“北斗七星像一個(gè)巨大勺子的形狀十分醒目，地位十分重要，也是我們最熟悉的星宿之一”就犯了強(qiáng)加因果的錯(cuò)誤，而原句是“北斗七星的地位一天比一天高起來(lái)，后來(lái)成了掌管人們生死的星宿”。

2.5 舒肝寧注射液對(duì)TEF肝臟肝細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用 ATP5A是線粒體ATP合成酶的重要組成部分。下圖中紅色熒光為ATP5A陽(yáng)性細(xì)胞，代表線粒體活性，F(xiàn)FA組ATP5A降低時(shí)紅色熒光少，說(shuō)明線粒體活性差；藍(lán)色熒光是DAPI染色的細(xì)胞核。舒肝寧注射液組ATP5A陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，提示線粒體活性增強(qiáng)(圖5)。對(duì)線粒體膜電位(MMP)進(jìn)行了JC-1熒光染色定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)舒肝寧注射液組MMP明顯高于FFA組(圖5C)(

<0.05)。ccc-P為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，是誘導(dǎo)線粒體膜電位(MMP)下降的陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.1 組織工程肝臟的制備 采用灌注法將SD大鼠肝臟去細(xì)胞化制為肝臟膠原支架，將人HepG2細(xì)胞種植到肝源性基質(zhì)支架中，建立與NAFLD患者肝臟平行的TE脂肪(TEF)肝模型，并用含500 μmol/L游離脂肪酸(油酸：棕櫚酸=2∶1)的高脂培養(yǎng)液培養(yǎng)8 d后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。人HepG2在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每隔2～3 d進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。制備了游離脂肪酸(FFA)，并將其作為脂肪補(bǔ)充培養(yǎng)基。油酸(OA)和棕櫚酸(PA)按2∶1比例用100%乙醇溶解，加入氫氧化鈉和DMEM 混合均勻，60℃超聲浴30 min。最后加入無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.4并過(guò)濾除菌。正常完全培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清)和高脂培養(yǎng)液分別建立組織工程肝(TE)和組織工程脂肪肝(TEF)模型。每天更換培養(yǎng)基。再細(xì)胞化5 d后，分別用不同稀釋濃度舒肝寧(10

～10

)處理3 d。伊紅染色(HE)進(jìn)行肝細(xì)胞組織病理檢查。

目前，云天化集團(tuán)及下屬企業(yè)正進(jìn)一步主動(dòng)融入和服務(wù)國(guó)家“一帶一路”倡議，主動(dòng)融入沿線國(guó)家相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，積極參與“孟中印緬經(jīng)濟(jì)走廊”和“中南半島”建設(shè)。一是構(gòu)建面向全球資源配置的貿(mào)易平臺(tái)，對(duì)于進(jìn)口原料，除鞏固進(jìn)口傳統(tǒng)區(qū)域外，還積極發(fā)力哈薩克斯坦、土庫(kù)曼斯坦等“一帶一路”沿線區(qū)域；二是構(gòu)建具有區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的海外營(yíng)銷體系，在越南、緬甸等“一帶一路”沿線國(guó)家設(shè)立分子公司，推動(dòng)企業(yè)國(guó)際化發(fā)展；三是充分發(fā)揮天川滙外貿(mào)綜合服務(wù)平臺(tái)作用，為云南乃至全國(guó)中小微企業(yè)提供全方位的“一站式”外貿(mào)綜合服務(wù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性 用普通平皿培養(yǎng)的細(xì)胞檢測(cè)舒肝寧注射液的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)加入不同稀釋度舒肝寧注射液，從10

到10

舒肝寧注射液對(duì)細(xì)胞均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，提示其安全性良好(圖1)。

1.4.5 活性氧(ROS)檢測(cè) 組織工程肝研磨的細(xì)胞重懸，再加入0.5 μl DCFH-DA，混勻后孵育、洗滌、離心。用熒光分光光度儀檢測(cè)分析。

2.2 肝臟病理組織學(xué)檢查 TEF肝臟出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)疏松化、細(xì)胞水腫、氣球樣變、核皺縮、核溶解等病理改變。舒肝寧組細(xì)胞壞死明顯減少(圖2)。

根據(jù)深層地?zé)豳Y源勘探工程N(yùn)S-A地?zé)峋┕そM織設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)要求及對(duì)組合測(cè)井資料的綜合分析，經(jīng)綜合研究分析，確定該地?zé)峋∮弥行陆y(tǒng)紅柳溝組下部及漸新統(tǒng)清水營(yíng)組級(jí)石炭系上部熱儲(chǔ)，確定取水段為1594.75～3167.11 m。止水位置確定在1555.84～1558.31 m、1559.11～1571.58 m。

2.4 氧化應(yīng)激檢測(cè) 加入10

的舒肝寧注射液后， 細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA水平明顯降低。(圖4)。

2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 加入10

的舒肝寧注射液可見(jiàn)TEF肝組織中綠色熒光細(xì)胞減少(提示細(xì)胞凋亡減少)，提示舒肝寧注射液對(duì)FFA引起的肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用(圖3)。用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組平均熒光強(qiáng)度(MFI)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)。

面向日益復(fù)雜多樣的環(huán)境問(wèn)題，西方傳統(tǒng)科學(xué)逐漸形成環(huán)境科學(xué)群，包括環(huán)境自然科學(xué)和環(huán)境社會(huì)科學(xué)兩大類別。McNeill[8]9曾說(shuō)：“環(huán)境涉及的學(xué)科之多，達(dá)到了知識(shí)追求所能達(dá)到的地步?！痹捳Z(yǔ)理解的多向度本質(zhì)和環(huán)境科學(xué)群的形成決定了環(huán)境話語(yǔ)理解的多向度本質(zhì)和環(huán)境話語(yǔ)研究的多學(xué)科向度。環(huán)境話語(yǔ)研究主要關(guān)涉的環(huán)境分支學(xué)科有生態(tài)語(yǔ)言學(xué)、環(huán)境社會(huì)學(xué)、環(huán)境傳播學(xué)、環(huán)境政治學(xué)、環(huán)境地理學(xué)、環(huán)境史學(xué)等。

1.4.6 線粒體膜電位(MMP)檢測(cè) 配制工作液、細(xì)胞懸液，充分混勻后在37℃避光孵育20 min。離心4 min，JC-1染色緩沖液洗滌，用適量JC-1染色緩沖液重懸后，用熒光分光光度儀檢測(cè)分析。

在新時(shí)代機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存背景下，廣東瑞豐生態(tài)環(huán)境科技股份有限公司專注土壤修護(hù)事業(yè)，走出了屬于自己的發(fā)展之路。為了共商土壤修護(hù)大計(jì)，構(gòu)建基層土壤修護(hù)服務(wù)模式，共同推進(jìn)綠色生態(tài)文明建設(shè)，11月18日，“千秋偉業(yè)激昂前行”中國(guó)首屆基層土壤修護(hù)服務(wù)體系發(fā)展論壇暨2018瑞豐生態(tài)（集團(tuán)）第五屆“未來(lái)之星”VIP客戶聯(lián)盟財(cái)富峰會(huì)在安徽黃山召開(kāi)。

3 討論

NAFLD是目前最常見(jiàn)的慢性肝病之一，發(fā)病機(jī)制不明。本研究采用灌注法將SD大鼠肝臟去細(xì)胞化制為肝臟膠原支架，將人HepG2細(xì)胞種植到肝源性基質(zhì)支架中，建立了與NAFLD患者平行的TE脂肪(TEF)肝模型。去細(xì)胞方法采用的是軍事科學(xué)院王韞芳團(tuán)隊(duì)的SDC/PLA2四步法

，該方法能在短時(shí)間內(nèi)完成肝臟的去細(xì)胞化，可以最大限度的保持肝臟的脈管系統(tǒng)以及細(xì)胞外基質(zhì)成分等。該支架是細(xì)胞移植的支撐和運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧分的重要基礎(chǔ)。該去細(xì)胞支架保留了>95%的膠原、黏附分子、彈性蛋白、蛋白多糖等。通過(guò)新型組織工程肝臟循環(huán)灌注高脂培養(yǎng)基，本研究組前期研究對(duì)該模型進(jìn)行了代謝、轉(zhuǎn)錄和表型等測(cè)定，結(jié)果表明成功獲取了體外NAFLD模型

。

有研究證實(shí)氧化應(yīng)激在NAFLD的病理生理過(guò)程中起重要作用，但相關(guān)機(jī)制研究較少。本研究通過(guò)建立FFA誘導(dǎo)體外的NAFLD模型，用舒肝寧注射液干預(yù)后進(jìn)行細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，CCK-8檢測(cè)提示舒肝寧注射液濃度從10

到10

均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，安全性良好；Tunel試驗(yàn)提示舒肝寧注射液可抑制FFA引起的細(xì)胞凋亡，同時(shí)可降低TEF肝臟MDA、活性氧(ROS)來(lái)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕FFA誘導(dǎo)的NAFLD從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。線粒體缺陷可能是NAFLD發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，因?yàn)樗淖兞四芰糠€(wěn)態(tài)，刺激ROS的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂肪氧化。脂肪氧化的增加會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，ROS與細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化損傷，這是細(xì)胞氧化應(yīng)激的經(jīng)典標(biāo)志。細(xì)胞一旦出現(xiàn)氧化應(yīng)激，會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因而，NAFLD被認(rèn)為是一種線粒體疾病。MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性。ROS、MDA都可直接造成細(xì)胞損傷, 最終導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化和癌癥

。

許鈞稱他在法國(guó)留學(xué)生涯中被法國(guó)語(yǔ)言文學(xué)的美深深吸引，這讓他看到了文學(xué)翻譯存在的意義，他希望和更多的中國(guó)讀者一起分享這種美的享受。他認(rèn)為“文學(xué)翻譯有其特殊性。文學(xué)，是文字的藝術(shù)，文化的一個(gè)組成部分，而文字中，又有文化的沉淀。文學(xué)翻譯既是不同語(yǔ)言的轉(zhuǎn)換活動(dòng)，也是一種藝術(shù)再創(chuàng)造活動(dòng)，同時(shí)也是一項(xiàng)跨文化的交流活動(dòng)?！盵9]

線粒體作為能量生產(chǎn)場(chǎng)所，是自由基、ROS衍生的主要部位，同時(shí)又可能是ROS攻擊的主要靶點(diǎn)。細(xì)胞呼吸關(guān)鍵蛋白三磷酸腺苷合成酶亞單位α(ATP5A)是ATP合成酶的一個(gè)亞單位，是氧化磷酸化(OXPHOS)的關(guān)鍵酶，ATP5A活性可能在細(xì)胞的能量生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。過(guò)量的脂肪通過(guò)改變OXPHOS的功能和減少ATP的產(chǎn)生來(lái)干擾能量代謝。線粒體氧化磷酸化缺陷可導(dǎo)致 ATP 產(chǎn)生減少和 ROS 產(chǎn)生增加。FFA可能通過(guò)降低OXPHOS活性來(lái)減少超氧化物歧化酶的產(chǎn)生。ATP5A降低暗示了細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)機(jī)制。FFA和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后，OXPHOS和ATP的生成減少

。舒肝寧注射液可能通過(guò)ATP5A抑制氧化應(yīng)激減輕FFA誘導(dǎo)的NAFLD。

新型組織工程肝為NAFLD的研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)，但本研究尚存在一定局限性，首先動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬真實(shí)的人體內(nèi)環(huán)境，單獨(dú)的人HepG2細(xì)胞不能模擬完整肝臟的多細(xì)胞環(huán)境。下一步研究將開(kāi)發(fā)包括星狀細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞，在微流控裝置內(nèi)灌注葡萄糖、胰島素和炎癥細(xì)胞因子，可以更好反映NAFLD的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)和病理生理變化，包括糖異生、氧化應(yīng)激、炎性和纖維化細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及星狀細(xì)胞的激活。

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